L’HPLC (Parte 2)

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Continua la descrizione dell’HPLC, per visionare la prima metà dell’articolo seguite il link: L’HPLC (Parte 1).

Utilizzo in laboratorio

Nella prima parte dell’articolo sono state definite le funzioni dell’HPLC, come la separazione di sostanze, la valutazione di purezza o la concentrazione di determinati componenti di un campione (Fig. 1). L’HPLC è uno strumento versatile che trova applicazioni in diversi ambiti di ricerca. Nel settore farmaceutico può essere utilizzato nella sintesi di nuovi farmaci oppure nelle analisi qualitative di materie prime o formulati (purezza, uniformità, stabilità). Nel campo biologico, genetico e biotecnologico, l’HPLC può essere utilizzato per analisi su peptidi, proteine ed amminoacidi ma anche per separare RNA o DNA.

Interessanti sono gli utilizzi di questo strumento in ambito ambientale, ad esempio il controllo delle acque alla ricerca di residui di fitofarmaci ed erbicidi utilizzati in agricoltura o inquinanti industriali. L’HPLC può essere utilizzato anche in campo alimentare con varie applicazioni: la ricerca di contaminanti (fitofarmaci, micotossine, antibiotici), la caratterizzazione dei diversi componenti (zuccheri, aminoacidi, acidi organici, polifenoli ecc) e le analisi di additivi alimentari (ad esempio i coloranti).

Nel settore chimico vengono fatte analisi di caratterizzazione di polimeri (determinazione e controllo della qualità) o saggi di purezza sui prodotti sintetizzati.

Vials utilizzate con l'hplc
Figura 1 – Vials contenenti campione da analizzre (Fonte: commons.wikimedia.org)

Funzionamento

Il funzionamento dell’HPLC ha come fondamenti la cromatografia liquida il cui principio è l’equilibrio chimico-fisico che risulta quando una sostanza è distribuita in due fasi. Come già affermato precedentemente le fasi sono una mobile (liquida, con le componenti da separare del campione) e una stazionaria (solida). I componenti vengono disciolti in una solvente per poi essere spinti, grazie a una pompa, all’interno della colonna applicando una pressione molto alta. Le componenti interagiscono con i costituenti della fase stazionaria e quindi fuoriescono in momenti diversi.

Le bande di soluto si espandono e si separano durante il passaggio nella colonna; quando una banda esce dalla colonna la sua concentrazione viene registrata e visualizzata come picco. I dati sono visualizzati tramite un cromatogramma (Fig. 2) ovvero un grafico con i picchi relativi alle concentrazioni delle varie sostanze rilevate presenti nel campione.

La capacità di migrare di una sostanza è determinata dal coefficiente di distribuzione (Kd), ovvero la percentuale del numero di molecole nella fase stazionaria sul numero di molecole nella fase mobile, all’equilibrio. Altri parametri fondamentali da prendere in considerazione durante l’analisi sono:

  • Tempo di ritenzione: tempo richiesto a una sostanza per essere eluita;
  • Fattore di ritenzione (o capacità di ritenzione): è costante per un sistema in cui ci sono la stessa fase stazionaria, fase mobile, soluto e temperatura;
  • Volume di ritenzione: è il volume di fase mobile che ha fluito nella colonna al tempo di ritenzione;
  • Efficienza (di una colonna): è l’ampiezza dei picchi (più è efficiente più i picchi sono stretti);
  • Selettività: misura della distanza tra i diversi picchi;
  • Risoluzione: termine usato per descrivere quantitativamente il risultato ottenuto.
Cromatogramma risultato dall'analisi con l'hplc
Figura 2 – Cromatogramma, in arancione un singolo picco (Fonte: Carola Pozzoli).

Limiti dello strumento

L’HPLC è uno strumento che può sembrare complicato per chi si approccia per le prime analisi: la scelta delle colonne ed eluenti giusti, oltre alla comprensione del funzionamento dello strumento in sé, può bloccare un neofita. Da ricordare però che ci sono davvero molti manuali e libri che trattano questo argomento sia per la scelta delle fasi, sia per la risoluzione dei problemi. I due limiti principali dell’HPLC che lo caratterizzano sono che non è un rilevatore universale e che è meno efficiente nella separazione rispetto a un gascromatografico con colonna capillare.

I vantaggi però dell’utilizzo di questo strumento sono vari. Le analisi quantitative fatte da HPLC sono rapide e precise, per non parlare del fatto che sono automatiche, evitando perdite di tempo. I rilevamenti per di più sono ad alta sensibilità ed è adatto a campioni di vario tipo; per le analisi è necessario davvero poco campione evitando così gli sprechi.

Precauzioni di utilizzo

L’HPLC è uno strumento molto complesso, sensibile e delicato, motivo per cui è importante utilizzarlo con cautela. Prima di tutto è necessario che i campioni siano il più puliti possibile perché, sebbene ci sia un sistema di filtrazione del campione all’interno dello strumento, ciò agevola le analisi e permette di evitare incrostazioni nella colonna. Il controllo della pressione è un fattore da prendere in considerazione: essa non deve variare durante l’utilizzo, né con picchi né con cadute, per evitare problemi alla colonna e scompensi che potrebbero portare a letture errate dei campioni durante le analisi.

Oltre alle considerazioni specifiche descritte sopra, è possibile riscontrare problematiche in ogni parte dello strumento (tendenzialmente piuttosto delicate). Quando si osserva un’anomalia è bene localizzare il problema e cercarlo di correggere (ovviamente nei limiti, spesso è meglio richiedere l’aiuto di un tecnico). Sarebbe sicuramente meglio utilizzare l’HPLC con il maggior riguardo possibile e cercare di prevenire situazioni spiacevoli. La manutenzione è fondamentale per tenere l’HPLC al massimo delle sue potenzialità di analisi ed evitare danni gravi per negligenza.

A parte le pressioni anomale e la pulizia del campione, altre criticità potrebbero essere perdite o problemi all’iniettore del campione. Una volta che si ha il cromatogramma, per di più, è molto importante leggerlo nel modo giusto. Spesso ci sono problemi di interpretazione o, in caso gli eluenti o le colonne non siano adatti alle analisi, i picchi potrebbero essere deformati, troppo grandi o distribuiti in modo anomalo. È necessario ricordare che i solventi utilizzati per la fase mobile possono essere tossici e, di conseguenza, l’utilizzo e lo smaltimento di essi vanno fatti in modo sicuro, sotto cappa e con indosso i dispositivi di protezione individuale quali guanti e camice.

Fonti

  • De Sio F. (1998). Introduzione all’HPLC – Manuale per corso di formazione “Addetti Controllo Qualità” 1997/1998.
  • Dong M. W. (2006). Modern HPLC for Practicing Scientists. John Wiley & Sons, Inc.
  • Snyder L.R, Kirkland J.J, Glajch J.L. (1997). Practical HPLC method development. A Wiley-Interscience Publication, John Wiley & Sons, Inc.
  • www.bmscience.net
  • www.disc.chimica.unipd.it
  • www.waters.com
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