Strumentazioni

Saccharomyces cerevisiae è un lievito, molto utilizzato nell’ingegneria metabolica (più di Escherichia coli) per 3 motivi principali:

• È considerato dalla Food e Drug Administration (FAD) degli Stati Uniti come un organismo G.R.A.S, ovvero un organismo generalmente considerato sicuro, in altre parole permette la produzione di molecole sicure e consumabili dall’uomo.
• Presenta una somiglianza filogenetica con le piante; pertanto, se in questo ceppo vengono messi nella giuste condizioni, gli enzimi che risiedono nelle piante possono funzionare con la stessa efficienza anche in questo microrganismo.
• Esprimono degli enzimi che fanno parte del complesso del citocromo P450, il quale permette il corretto svolgimento delle razioni che avvengono nella via del fenilpropanoide. Di conseguenza, permette la creazione di flavonoidi.

Nel corso del tempo, molti lavori si sono basati sul tentativo di realizzare una produzione di flavonoidi, ma tutti hanno avuto basse rese di produzione, concludendo che ci sono dei fattori limitanti ignoti che riducono le quantità di produzione.

Produzione di (2S)-NARINGENINA

In un recente studio condotto sulla produzione del flavanone (2S)-naringenina, i ricercatori si sono domandati se una volta individuati i fattori limitanti e costruendo una via bio-sintetica della (2S)-naringenina all’interno di Saccharomyces cerevisiae, sia possibile, poi, riuscire ad effettuare una produzione in scala industriale di questa molecola. Per rispondere a questa domanda, hanno ingegnerizzano questo microrganismo mediante l’utilizzo di geni eterologhi (geni che provengono da altri organismi), i quali codificano per gli enzimi della via biosintetica del fenilpropanoide:

• Flavobacterium  jhonsoniae: FJ TAL;
• Petroselielum crispum: PC 4CL;
• Petunia X hybrida: PH CHS;
• Medicago sativa: MS CHI.

Esperimento di produzione

I ricercatori hanno inserito i geni eterologhi all’interno dei plasmidi, i quali, successivamente, sono stati introdotti in E. coli. All’interno di questo batterio è avvenuta la trasformazione, l’amplificazione e la conservazione del DNA plasmidico modificato. Dopodiché, i plasmidi sono stati immessi all’interno di Saccharomyces cerevisiae mediante il metodo dell’acetato di litio che causa la permeabilizzazione della membrana citoplasmatica del lievito, permettendo quindi l’ingresso dei plasmidi all’interno della cellula. Per verificare la corretta introduzione dei plasmidi, gli scienziati hanno effettuato il sequenziamento di Sanger. Il lievito, una volta ingegnerizzato, ha preso il nome di Saccharomyces cerevisiae Y100, e in seguito il ceppo modificato è stato inoculato all’interno di un terreno di coltura sintetico Drop-Out composto da:

• 20 g/L di Glucosio
• 1,75 g/L di basi azotate
• 5 g/L di ammonio solfato
• 50 mg/L di amminoacidi (leucina, triptofano e istidina)

Le colonie cresciute all’interno di questo terreno sono state, successivamente, inoculate all’interno di un bioreattore di vetro da 5 L che conteneva un terreno di coltura YPD (estratto di lievito, peptone e destrosio) ed incubato per 72 ore a 30°C.

Risultato dell’esperimento

La via del fenilpropanoide, bio-ingegnerizzata in saccharomyces cerevisiae Y100 (Fig. 5), parte dal glucosio, il quale, attraverso la glicolisi e via dei pentosi fosfati, viene trasformato rispettivamente in fosfoenol-piruvato ed eritrosio 4-fosfato. Questi due metaboliti, di conseguenza, entreranno nella via dello shikimato condensando grazie all’azione dell’enzima DAHP sintasi, codificato dal gene ARO4, che lo trasforma in Acido 3-deossi D-arabino eptulosonico 7-fosfato (DAHP). Successivamente, il DAHP reagisce con l’enzima 3-fosfo shikimato 1-carbossi vinil trasferasi, codificato da ARO1, che lo trasforma in 5-enol piruvil shikimato 3-fosfato (EP3P). In seguito, l’EP3P reagirà con l’enzima corismato sintasi, codificato da ARO2, che lo trasforma in corismato, il quale reagisce con l’enzima Corismato mutasi, codificato da ARO7, che lo converte in Prefanato.

Il prefanato reagisce con l’enzima prefanato deidrogenasi, codificato da TYR1, generando la Tirosina. Dipoi, la Tirosina entra nella via del fenilpropanoide, dove viene trasformata dall’enzima FJ-TAL in acido p-cumarico, il quale sarà trasformato in p-cumaroil-CoA da parte dell’enzima PC-4CL. Dopodiché, il p-cumaroil-CoA reagisce con l’enzima Sm-CHS2 (calcone sintasi di Silybium marianum) diventando Calcone–naringenina che reagirà, a sua volta, con l’enzima Ms-CHI (calcone isomerasi di Medicago sativa) diventando (2S)-naringenina.

I risultati ottenuti dalla via biosintetica ingegnerizzata inizialmente sono stati molto scarsi, ottenendo una produzione totale di 63,25 mg/L della molecola, pertanto, sono stati fatti dei miglioramenti attuando delle modifiche su alcuni enzimi. Un esempio è la soppressione e la sovra-espressione di determinati geni implicati nella via del fenilpropanoide, che hanno dato negli altri ceppi mutanti di Saccharomyces cerevisae (ceppo Y205,Y206 e Y207) una produzione totale di 648,63 mg/L di (2S)-naringenina (Fig 6).

Fattori limitanti

La creazione della via biosintetica per la produzione della (2S)-naringenina ha fatto notare ai ricercatori la presenza di fattori che limitavano la produzione della molecola. Pertanto, risolvendo queste limitazioni è possibile migliorarne il processo:

• L’enzima Calcone sintasi (CHS) influenza la produzione della (2S)-naringenina, che possiede un’efficienza che varia da specie in specie; dunque, per risolvere questo limite, bisognerebbe individuare la specie che possiede un CHS più efficiente ed aumentare il suo numero di copie.
• Il malonil-CoA limita la produzione della (2S)-naringenina, poiché nel processo servono 3 molecole. Un modo per risolvere questa problematica è quella di aumentare i livelli di malonil-CoA mediante la sovra-espressione dei geni che codificano gli enzimi che lo producono come piruvato decarbossilasi, acetaldeide deidrogenasi e acetil-CoA carbossilasi.

Fonti

• •Metabolic Engineering of Microbial Cell Factories for Biosynthesis of Flavonoids: A Review; H. Lou, L. Hu, H. Lou, T. Wei, Q. Chen; Molecules. 2021; 26(15):4522. https://doi.org/10.3390/molecules26154522
• •Biosynthesis and biotechnological production of flavanones: current state and perspectives; Fowler, Z.L., Koffas, M.A.G. Appl Microbiol Biotechnol83, 799–808 (2009). https://doi.org/10.1007/s00253-009-2039-z
• •Metabolic Engineering of Microorganisms for the Production of Flavonoids; H. Sheng; X. Sun, Y. Yan, Q. Yuan, J. Wang, X. Shen; 2020; https://doi.org/10.3389/fbioe.2020.589069
• •Efficient Biosynthesis of (2S)-Naringenin from p-Coumaric Acid in Saccharomyces cerevisiae; S. Gao, Y. Lyu, W. Zeng, G. Du, J. Zhou, J. Chen; 2019; American Chemical Society; https://doi.org/10.1021/acs.jafc.9b05218
• •Saccharomyces Genome Database: https://www.yeastgenome.org/locus/S000001179