Kligler Iron Agar (KIA)

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Perché si usa?

Il Kligler Iron Agar è un terreno di coltura utilizzato per la differenziazione delle Enterobacteriaceae, basata sulla capacità propria di questi batteri di fermentare gli zuccheri come il glucosio e il lattosio, e di produrre acido solfidrico (H2S) o anidride carbonica (CO2).

Composizione del terreno

Kligler Iron Agar g/l

  • Estratto di carne 3,0 g 
  • Estratto di lievito 3,0 g 
  • Pepto Complex 20,0 g 
  • Lattosio 10,0 g 
  • Glucosio 1,0 g 
  • Ferro solfato 0,20 g 
  • Sodio tiosolfato 0,30 g 
  • Sodio cloruro 5,0 g 
  • Rosso fenolo 0,025 g 
  • Agar 12,0 g 
  • Acqua purificata 1000 mL

    pH (20-25°C) 7,4 ± 0,2

Come funziona?

L’agar è disposto a becco di clarino; la porzione superiore è esposta all’ossigeno, dove forma una camera aerobia, mentre il fondo ne è privo e costituisce quindi una camera anaerobia.

L’attività degli enterobatteri viene evidenziata dal viraggio del colore del terreno: giallo per quanto riguarda la fermentazione degli zuccheri, nero invece per la produzione di acido solfidrico. Il rosso fenolo è presente come indicatore di pH, mentre il ferro ammonio citrato è presente come indicatore di acido solfidrico.

Diverse reazioni

A seconda della popolazione batterica presente, le reazioni che si verificano nel terreno possono essere diverse:

Superficie basica/Fondo basico. Nessuna variazione del terreno, poiché non avviene alcuna fermentazione dei carboidrati. In questo caso è possibile notare la degradazione dei peptoni. Se questa avviene in condizione aerobica, non porta ad alcuna variazione di colore; se invece avviene in  anaerobiosi, il terreno virerà verso il rosso (pH alcalino).

Superficie basica/Fondo acido. Fermentazione del glucosio, ma non del lattosio. Una volta utilizzato completamente il glucosio nella parte superiore del terreno, dove esistono condizioni aerobie, il catabolismo degli amminoacidi induce la produzione di ione ammonio. Di conseguenza, si noterà il viraggio del rosso fenolo verso il rosso; il terreno quindi, inizialmente diventato acido, ritorna alcalino. Sul fondo, invece, la fermentazione del glucosio porta alla formazione di acidi, con conseguente viraggio dell’indicatore verso il giallo. Questo meccanismo è tipico dei batteri del genere Shigella.

Superficie acida/Fondo acido. Acidificazione del terreno completa per via dell’azione dei batteri fermentanti il lattosio, quali E. coli o Klebsiella. Alla lettura il terreno si presenta interamente di colore giallo.

Altre reazioni:

  • Produzione di CO2 da parte degli organismi, visibile con degli spazi che si creano dentro al terreno.
  • In alcuni casi la porzione del fondo può presentarsi di colore nero, per via della produzione di acido solfidrico da parte dei batteri. Il colore nero copre il giallo del terreno, che risulta comunque acido.

Preparazione del terreno

Il Kligler Iron Agar è un terreno pronto in polvere che richiede pochi passaggi per la preparazione:

  • Portare ad ebollizione mescolando bene e raffreddare fino a 50-55 °C;
  • Solidificare il terreno in modo da fargli prendere una forma a “becco di clarino”;
  • Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15 minuti;
  • Mettere una data di produzione del terreno e stoccarlo al buio ad una temperatura di 2-8 °C.

Risultati della crescita

BatteriopH Superficie/Fondo dopo reazioneProduzione di CO2Produzione di H2S
P. aeruginosaBasico/BasicoNegativaNegativa
E. coliAcido/AcidoPositivaNegativa
Shigella spp.Basico/AcidoNegativaNegativa
Salmonella TyphiBasico/AcidoPositivaNegativa
Klebsiella pneumoniaAcido/AcidoPositivaNegativa
Proteus mirabilisBasico/AcidoPositivaPositiva

Immagini

Primo piano del KIA Agar con diverse reazioni di pH.
Figura 1 – Kligler Iron Agar con diverse reazioni; da sinistra: produzione di gas; reazione basica/acida; produzione di acido solfidrico; reazione negativa [Fonte: Scharlab.com].
Flaconi di KIA agar con diverse reazioni.
Figura 2 – Reazioni su Klingler Iron Agar; da sinistra, coltura negativa; E. coli e S. typhimurium [Fonte: biolifeitaliana.it]

Limitazioni all’utilizzo del terreno

La lettura delle reazioni va eseguita tra le 18 e le 24 ore di incubazione. Infatti, letture precoci inducono false interpretazioni di acidità, mentre letture tardive portano a dare falsi risultati di alcalinità dovuti al progressivo utilizzo dei peptoni nel terreno.

Infine, l’identificazione completa dei microrganismi deve essere effettuata con tecniche biochimiche,
immunologiche, molecolari o di spettrometria di massa.

Fonti

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