Rose Bengal Agar

Utilizzo

Il Rose Bengal Agar (Fig.1) è un terreno di coltura selettivo indicato per l’isolamento e il conteggio di muffe e lieviti da campioni ambientali e alimentari.

Colonia di muffa su Rose Bengal Agar
Figura 1 – Colonia di muffa su Rose Bengal Agar [Fonte: labolytic.no]

Composizione

La formula per “l” di terreno di coltura è riportata in Tabella 1:

ReagentiQuantità (g/l)
digerito di soia (con enzima papaina)5,000
destrosio10,000
fosfato monopotassico1,000
magnesio solfato0,500
rosa bengala0,050
agar15,000
Tabella 1 – Formula per preparare 1 l di terreno [Fonte: Scheda Tecnica HIMEDIA]

Il pH finale del mezzo a 25°C è di 7,2 ± 0,2.

Come riportato sopra, il Rose Bengal Agar è un terreno di coltura indicato per l’identificazione ed il conteggio di muffe e lieviti a partire da campioni alimentari e ambientali.
L’utilizzo di un terreno di coltura acido potrebbe inibire lo sviluppo dei batteri a favore dei funghi che crescerebbero vigorosamente, tuttavia, è stato dimostrato che i terreni di coltura neutri (come il Rose Bengal) con aggiunta di antibiotici sono ancora più performanti in questo senso. Tra gli antibiotici più impiegati vi sono il cloramfenicolo, la streptomicina, l’ossitetraciclina e la clortetraciclina.

L’ultima versione del Rose Bengal Agar modifica la formula di Jarvis, sostituendo l’antibiotico clortetraciclina con il cloramfenicolo. Quest’ultimo, infatti, è maggiormente resistente alle alte temperature ed è dotato di un più ampio spettro d’azione.
Il digerito enzimatico di soia mette a disposizione il carbonio e l’azoto necessari per lo sviluppo microbico, il destrosio funge da fonte energetica, mentre il fosfato monopotassico ha un’azione tamponante.
Il magnesio fosfato fornisce gli elementi in tracce, mentre il colorante rosa bengala inibisce lo sviluppo dei batteri e limita la crescita delle muffe che si sviluppano più rapidamente migliorandone l’isolamento e il conteggio.

Preparazione

Per la preparazione del terreno è necessario seguire questi passaggi:

  1. Sospendere 31,55 g di polvere in 1 l di acqua distillata.
  2. Riscaldare fino ad ebollizione e fino al completo scioglimento delle polveri.
  3. Autoclavare a 121°C per 15 minuti.
  4. Far raffreddare il terreno fino a 40-45°C e aggiungere 2 ml di cloramfenicolo per 500 ml di medium.
  5. Mescolare e successivamente versare in una piastra Petri sterile.

Metodo

Per un eventuale conteggio, bisogna addizionare 1 ml di aliquota della serie di diluizioni nella piastra Petri. Successivamente si cola il terreno freddo, si mescola accuratamente e si lascia ad incubare per 5 giorni a 25°C. Al termine dell’incubazione è possibile calcolare il numero di colonie di lievito/muffa per 1 g o 1 ml di terreno, moltiplicando il numero delle colonie osservate per il fattore di diluizione. Per capire come effettuare correttamente le diluzioni è possibile visionare il Vid.1 al link sottostante:

Risultati della crescita

Sul Rose Bengal Agar le colonie di lievito appaiono rosate a causa della presenza del colorante rosa bengala, mentre le colonie di muffa mantengono l’aspetto caratteristico, sopraelevato, filamentoso, dal bianco al grigio scuro, al nero.

Immagini

I risultati della crescita possono essere osservati in Fig. 2 e 3:

Colonia di Fusarium su Rose Bengal Agar
Figura 2 – Colonia di Fusarium su Rose Bengal Agar [Fonte: inspq.qc.ca]
Colonie rosate di lievito sull'agar rosa bengala
Figura 3 – Colonie rosate di lievito sull’agar rosa bengala [Fonte: scharlab.com]

Limitazioni

Il Rose Bengal Agar è un terreno selettivo, tuttavia, alcune specie fungine potrebbero svilupparsi poco o non svilupparsi. Inoltre, alcuni batteri potrebbero non essere del tutto inibiti e crescere parzialmente al di sopra di esso.
E’ necessario evitare che il terreno venga esposto alla luce altrimenti il processo di fotodegradazione del rosa bengala potrebbe indurre la liberazione di composti tossici per i funghi.

Controllo qualità

La miscela in polvere del terreno deve apparire dal giallo chiaro al rosa, deve essere omogenea e priva di grumi. Il terreno di coltura solido deve avere consistenza paragonabile ad 1,5% di gel di agar e deve apparire rosa scuro leggermente opalescente. Per il controllo qualità si devono seguire i parametri riportati in Tabella 2:

MicrorganismoInoculo (CFU)CrescitaRecupero
Aspergillus brasiliensis ATCC 1640450-100Buona
Candida albicans ATCC 10231 (Fig.4)50-100Buona<=50%
Escherichia coli ATCC 25922>= 103Inibita0%
Micrococcus luteus ATCC 10240>=103Inibita0%
Saccharomyces cerevisiae ATCC 976350-199Buona<=50%
Tabella 2 – Parametri per il controllo qualità [Fonte: [Fonte: Scheda Tecnica HIMEDIA]
Colonie di C. albicans su Rose Bengal Agar
Figura 4 – Colonie di C. albicans su Rose Bengal Agar [Fonte: preclaboratories.com]

Fonti

  • Scheda Tecnica HIMEDIA;
  • Rose Bengal Agar;
  • Mossel D. A. A., Visser M. and Mengerink W. H. J., 1962, Lab Practice 11:109;
  • Beuchat L. R. and Cousin M. A., 2001, In Downes F. P. and Ito K., (Eds.), Compendium of Methods for the MicrobiologicalExamination of Foods, 4th Ed., American Public Health Association, Washington, D.C.
Crediti tabelle
Crediti video
Crediti immagini
Foto dell'autore

Giulia Baldi

Biologa A iscritta all'albo professionale. Laureata in Scienze Biologiche e in Biologia Agro-Ambientale con tirocini in ambito clinico (laboratorio di microbiologia e virologia) e ambientale (laboratorio di ricerca in interazioni pianti-ambiente). Master di II livello in Sicurezza Alimentare e Sistemi di Gestione.

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