Enterotube

Principio

L’enterotube è un semplice sistema colorimetrico utilizzato per l’identificazione e la classificazione di vari batteri enterici. I più studiati sono gli enterobatteriacee, ampia famiglia batterica che si riscontra all’interno dell’intestino animale e umano.

Questi batteri sono tra loro molto simili con caratteristiche biochimiche ed antigeniche estremamente affini che rende difficile la loro classificazione.

L’enterotube è essenzialmente una sonda di plastica, costituita da 12 celle a loro volta riempite con differenti combinazioni di terreno di coltura, reagenti ed indicatori. Gli indicatori hanno il compito di virare verso un colore selezionato se rileva condizioni specifiche o sostanze precise presenti nella cella. La presenza di queste sostanze permette di classificare gli entero batteri in base al loro metabolismo. Le 12 celle costituenti sono in comunicazione tramite un ago che permette anche l’inoculazione diretta dei batteri. La sonda è delimitata da due tappi che fanno anche da protezione per l’impugnatura e dallo spillo dell’ago di inoculazione.

Metodo

Si rimuovono i tappi e tramite l’ago si procede al prelievo della colonia batterica, coloniacon forma circolare per ridurre al minimo la possibilità di prelevare anche batteri differenti. Una volta prelevata la colonia, è posta in una singola cella delle 12 presenti nel tubo. Per riuscire in questa manovra, l’ago può essere tirato fino a metà dell’ultima cella e qui si può inoculare la colonia selezionata.

La procedura viene ripetuta per il numero di batteri da individuare. Alcune celle dispongono di specifiche aperture per l’entrata dell’ossigeno, necessario per alcune colonie aerobiche.

Una volta terminato, l’enterotube è posto su una superficie piana incubato a 37° gradi per ventiquattro ore.

Trascorse le ore necessarie, si procede alla lettura e all’interpretazione. I risultati sono rilevabili in modo estremamente facile in quanto basta confrontare le diverse colorazioni assunte dai terreni in coltura con una legenda disposta in precedenza.

Molto spesso si procede all’incubazione con due enterotube, uno inoculato ed uno non inoculato, in modo da avere un riferimento.

Risultati attesi

Come detto, enterotube permette di identificare colture batteriche specifiche, ma anche determinati tipi di metabolismo. Una volta completato il test ci sono vari aspetti da considerare.

Le celle presenti nella sonda rappresentano 12 differenti tipi di metabolismo. In una viene considerata la fermentazione degli zuccheri. Se in questo comparto, ad esempio, non si presenta nessuna variazione cromatica o il batterio non fa parte dei batteri ricercati o della famiglia in esame. Per cui la variazione cromatica è un po’ alla base delle rilevazioni.

Glucosio, adonitolo, lattosio, arabinosio e sorbitolo sono tutti testati. 

Molti batteri utilizzano l’urea come fonte primaria di azoto, scindendola in ammoniaca e anidride carbonica, grazie all’enzima ureasi. L’ammoniaca determina aumento di pH. Il pH e anche l’enzima sono presi in considerazione nel test.

Non va dimenticata la decarbossilasi, utile per la differenziazione dei batteri. I batteri con decarbossilasi determinano la formazione di prodotti di scarto, quali cadaverina e putrescina, responsabili di sensibili cambiamenti cromatici nel test. Nello specifico porpora per la cadaverina e viola per la putrescina.

Il test rivela anche i batteri che utilizzano il citrato come fonte di carbonio. I metaboliti che si formano creano variazioni cromatiche basate sul verde, e in alcuni casi si giunge anche al blu intenso.

 Infine, altri batteri convertono il destrosio e il glucosio in piruvato utilizzando diverse vie metaboliche. Alcuni utilizzano la via del glicole butilenico, che produce prodotti finali neutri, tra cui acetilmetilcarbinolo (acetoina) e 2,3-butandiolo. Il test Voges-Proskauer (VP) rileva gli organismi che utilizzano la via del glicole butilenico e producono acetoina durante il metabolismo del glucosio. Dopo l’inoculazione e l’incubazione dell’enterotube, si rileverà un colore rosso.

Limitazioni del test

Il test presenta alcune limitazioni. Enterotube è pensato come un sistema per l’identificazione di batteri gram-negativi ossidasi-negativi ed in grado di differenziare la famiglia delle enterobatteriacee. Per altri tipi di batteri come, ad esempio, i gram-positivi sono necessari altri test biochimici.

Per questa ragione ha innanzitutto dei limiti numerici, in quanto non tutti i batteri possono essere identificati nel medesimo test. Oltre a questo, per alcuni batteri, come ad esempio Salmonella e Shigella spp., sono necessari test sierologici per confermare l’eventuale diagnosi. Anche il tempo di incubazione può comportare problematiche identificative. Infatti, alcuni microrganismi necessitano di maggior tempo di incubazione ed i risultati ottenuti possono essere alterati. 

Risulta essere un test non definitivo ma una prima necessaria indagine, sia nella ricerca che nella eventuale diagnosi.

Per le diagnosi, data la grande variabilità, gli isolati ottenuti dal test vengono inviati a laboratori di riferimento che eseguono test più approfonditi.

Quality control

Il test ha molte variabilii in grado di alterarne i risultati. Per ridurre alla minor percentuale la possibilità di errore, i controlli sono necessari. La coltura batterica da sottoporre all’enterotube deve essere eseguita in modo ottimale, possibilmente creandone una forma circolare in modo da facilitare l’inoculazione. Vanno seguite le raccomandazioni, la conservazione e l’utilizzo specificate dai produttori.

Fonti

• Immagine in evidenza: https://it.m.wikipedia.org/wiki/File:Enterotube®_identification_kit_5421_lores.jpg
• Figura 1: https://www.liofilchem.com/images/brochure/enteropluritest.pdf
• Figura 2: http://www.davidesbarbada.com/sicurezza/downloads/2005-2006/Organica/UsoEnterotube.pdf