Principio
Il saggio MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio bromuro) è un test colorimetrico ampiamente utilizzato per valutare la vitalità cellulare. Il principio si basa sulla capacità delle cellule metabolicamente attive di ridurre l’MTT, un sale tetrazolico giallo, a cristalli di formazano viola, insolubili e quantificabili mediante lettura spettrofotometrica. Il grado di assorbanza rilevato è proporzionale al numero di cellule vive presenti.
Metodo del saggio MTT
Il saggio MTT viene generalmente condotto in piastre da 96 pozzetti per consentire un’analisi quantitativa ad alta densità. I passaggi principali includono:
- Semina delle cellule: le cellule da testare vengono seminate nei pozzetti e lasciate aderire/incubare per 24 ore.
- Trattamento: le cellule vengono esposte al trattamento desiderato (come farmaci, estratti, condizioni ambientali, ecc.).
- Aggiunta dell’MTT: dopo un periodo di incubazione (solitamente 24–72 h), si aggiunge la soluzione di MTT.
- Incubazione: si lascia reagire per 2–4 ore, durante le quali le cellule vitali riducono l’MTT.
- Solubilizzazione del formazano: i cristalli formati vengono solubilizzati con un solvente (ad esempio DMSO, isopropanolo acido).
- Lettura spettrofotometrica: l’assorbanza viene letta a 570 nm (con correzione a 630–690 nm per il background).
Risultati attesi
Il saggio MTT consente di determinare:
- La percentuale di vitalità cellulare rispetto al controllo non trattato.
- La citotossicità di sostanze in esame, espressa come IC₅₀ (concentrazione che inibisce la vitalità del 50%).
- L’effetto proliferativo o antiproliferativo di agenti testati.
I risultati vengono generalmente espressi come percentuale di vitalità (media ± deviazione standard) o tramite curve dose-risposta.
Limitazioni del saggio MTT
Sebbene ampiamente utilizzato, il saggio MTT presenta alcune limitazioni:
1. Interferenze chimiche
- Alcune sostanze testate possono ridurre direttamente l’MTT, falsando così i risultati.
- Colori o precipitati dei composti testati possono interferire con la lettura spettrofotometrica.
2. Sensibilità alla densità cellulare
- Il test richiede un’ottimizzazione preliminare del numero di cellule per evitare saturazione del segnale o insensibilità.
3. Solubilizzazione incompleta
- La completa solubilizzazione dei cristalli di formazano è essenziale per una lettura accurata. Inoltre, l’uso di solventi inadeguati può compromettere i risultati.
4. Rilevazione indiretta della vitalità
- Il test misura l’attività metabolica e non distingue tra cellule vive, ma metabolicamente inattive, e cellule morte.
Quality control
Controlli interni
- Controllo positivo: trattamenti noti per indurre citotossicità (ad esempio Doxorubicina).
- Controllo negativo: cellule non trattate, al fine di determinare la vitalità basale.
- Controlli di background: pozzetti con solo mezzo e MTT, senza cellule.
Ripetibilità e riproducibilità
- Tutti i test dovrebbero essere eseguiti in almeno triplicato.
- Ogni esperimento dovrebbe essere ripetuto in almeno tre sessioni indipendenti.
Calibrazione strumentale
- Il lettore di micropiastre deve essere calibrato regolarmente.
- È consigliato l’uso di curve standard, ove applicabile.
Fonti:
- Sigma-Aldrich – Saggi di proliferazione e vitalità cellulare
- Jove – Saggio del metiltiazolil tetrazolio o MTT: un test colorimetrico per misurare la resistenza ai farmaci attraverso la determinazione dell’attività metabolica nelle cellule tumorali
- Kumar P, Nagarajan A, Uchil PD. Analysis of Cell Viability by the MTT Assay. Cold Spring Harb Protoc. 2018 Jun 1;2018(6). doi: 10.1101/pdb.prot095505. PMID: 29858338.
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