Test dell'utilizzo del citrato

Principio

Il test di utilizzo del citrato è comunemente impiegato nell’ambito di un gruppo di test che distinguono i membri della famiglia delle Enterobatteriacee in base ai loro sottoprodotti metabolici. Il test di utilizzo del citrato viene impiegato, assieme ad altri test metabolici, per determinare la capacità dei batteri di utilizzare il citrato di sodio come unica fonte di carbonio e il fosfato di monoammonio (NH₄H₂PO₄) come unica fonte di azoto. Alcuni kit di test come l’API-20E e l’Enterotube II includono il mezzo di utilizzo del citrato come uno dei test diagnostici.

In questo test viene solitamente usato il terreno di Simmons, la cui composizione è la seguente:

Figura 1 – componenti del terreno di Simmons

Dall’utilizzo di un acido organico come il citrato come fonte di carbonio ed energia, i prodotti finali risultano essere carbonati alcalini e bicarbonati. Inoltre, l’idrossido di ammonio risulta come prodotto quando i sali di ammonio nel mezzo vengono utilizzati come unica fonte di azoto. L’utilizzo del citrato esogeno richiede la presenza di proteine di trasporto del citrato. Al momento dell’assorbimento da parte della cellula, l’enzima citrato liasi scinde il citrato in ossaloacetato e acetato. L’ossaloacetato viene quindi metabolizzato in piruvato e CO2.

Citrato = acetato + Ossalacetato ; Ossalacetato = piruvato + CO2

L’anidride carbonica rilasciata reagirà successivamente con l’acqua e lo ione sodio nel mezzo per produrre carbonato di sodio, un composto alcalino che aumenterà il pH. Inoltre, l’idrossido di ammonio viene prodotto quando i sali di ammonio nel mezzo vengono utilizzati come unica fonte di azoto. La crescita di solito determina una modifica colorimetrica dal verde al blu. L’indicatore di pH blu di bromotimolo è di un verde intenso a pH neutro. Con un aumento del pH medio superiore a 7,6, il blu di bromotimolo diventa blu.

Figura 2 – crescita microbica positiva di colore blu paragonata ad assenza di crescita, di colore verde

Figura 3 – altra immagine che rappresenta il test dell’utilizzo del citrato positivo di colore blu e negativo di colore verde, sia nelle provette che in piastra

I microrganismi che saranno positivi al test dell’utilizzo del citrato sono:

Klebsiella pneumoniae
Enterobacter spp.
Citrobacter freundii
Salmonella spp.
Serratia marcescens
Proteus mirabilis
Providencia spp.

I microrganismi che non saranno positivi al test dell’utilizzo del citrato sono:

Escherichia coli
Shigella spp.
Salmonella typhi
Salmonella paratyphi A
Morganella morganii
Yersinia enterocolitica

Altri microrganismi daranno dei risultati variabili in base ai ceppi di riferimento:

Proteus vulgaris
Vibrio cholerae
Vibrio parahaemolyticus

Metodo

Inoculare nel terreno di Simmons una colonia incubata tra le 18 e le 24 ore;
Incubare tra 35 °C e 37 °C per 18-24 ore;
Osservare lo sviluppo di colore blu che ne indicherà la crescita.

Risultati attesi

Crescita: la crescita sarà visibile nel mezzo, che sarà di un intenso colore blu. Questo in quanto i carbonati alcalini e i bicarbonati prodotti come sottoprodotti del catabolismo del citrato aumentano il pH del mezzo a oltre 7,6, facendo cambiare il blu di bromotimolo dal colore verde originale al blu.
Assenza di crescita: Non si verificherà alcun cambiamento di colore ed il mezzo rimarrà di colore verde. Solo i batteri che possono utilizzare il citrato come unica fonte di carbonio ed energia saranno infatti in grado di crescere sul terreno di Simmons, quindi una coltura citrato-negativa sarà praticamente indistinguibile da una terreno senza inoculo.

Limitazioni del test

Alcuni microrganismi sono in grado di crescere sul citrato e non producono un cambiamento di colore;
Alcuni test possono dare dei risultati equivoci e dovrebbero essere ripetuti;
Diversi microrganismi possono richiedere fino a 7 giorni di incubazione a causa del loro tasso di crescita limitato sul terreno;
Le reazioni di questo mezzo da solo non sono sufficienti per l’identificazione a livello di specie.