CRISPR-Cas: da premio Nobel a test rapido

“L’ennesimo test rapido che ci propinano… ma basta!!”

Ecco, probabilmente questa è una delle affermazioni che nel maggiore dei casi sarà venuta in mente a chi avrà letto almeno il titolo di questo articolo, probabilmente fermandosi solo a quello come accade in molti casi.

Magari invece qualche temerario avrà effettuato il “click” ed ora sta leggendo queste righe, per comprendere il perché siamo di nuovo qui a parlare di test rapidi e perché è giusto continuarne a parlare. Ormai siamo bombardati da informazioni che spesso e volentieri tendono più che a fare chiarezza, a creare una grande confusione. Questo articolo non si prefigge l’idea di entrare a far parte di questo buio totale, ma nasce con l’idea di tenervi sempre aggiornati su quello che accade, cercando di accendere una piccola luce che possa iniziare a schiarire la via.

La situazione di oggi

Ad oggi, dopo quasi 8 mesi dall’inizio della pandemia da SARS-coV-2, siamo dotati di diversi strumenti in grado di poter effettuare una diagnosi della patologia in un soggetto infetto. Lo strumento maggiormente utilizzato e più sicuro (dove per più “sicuro” intendiamo quello che è in grado di darci risultati più attendibili) è il tampone molecolare.

In questa metodica, l’analisi del campione prelevato dal paziente, viene effettuata tramite una tecnologia definita Real Time PCR (RT-PCR). La RT-PCR non è affatto una tecnologia nuova al mondo scientifico ma nei laboratori viene utilizzata da anni, questo perché essa rappresenta una metodica semplice, sensibile e specifica.

Un cocktail di caratteristiche che la rendono molto affabile in diversi esperimenti, ed anche, in questa pandemia. Qual è il problema allora?

Immaginate di essere un ricercatore o un tecnico di laboratorio, avete un progetto di ricerca tutto vostro e ci state lavorando su utilizzando questa tecnica. Se per ottenere i vostri dati impiegate 24, 48 o 72 ore, non vi cambierà nulla, sì magari vorreste ottimizzare il vostro tempo per dedicarvi anche ad altro oppure vorreste semplicemente andare più veloci per finire prima, ma di fondo non vi cambierebbe nulla.

Ora invece immaginate di essere un tecnico di laboratorio, un biologo alle prese con milioni di campioni da analizzare per fare una diagnosi di Covid-19. La vera chiave di tutto può essere il TEMPO.

I limiti della RT-PCR

La RT-PCR è una tecnica estremamente sensibile in grado di andare ad identificare la presenza dell’RNA virale nel campione analizzato, a concentrazioni estremamente basse, ovvero 1000 copie/ml (1 copia/ microl).

Il suo limite però rimane proprio il tempo.

Per ottenere i risultati tramite questa tecnica occorrono diverse ore di azione, che unite al tempo di arrivo del campione in laboratorio ed al tempo per informare il soggetto del risultato, possono creare delle problematiche, soprattutto nei periodi più “caldi” che stiamo vivendo in questi giorni, dove addirittura si fanno file interminabili ai drive-in o si attendono anche 48 ore per il proprio risultato.

Per questi ed altri motivi, si sta cercando di optare verso i cosiddetti test rapidi, test che in pochi minuti riescano a darci un risultato affidabile. Molti test rapidi sono già in commercio e probabilmente molti di voi li avranno già utilizzati, mentre altri sono ancora alle ultime fasi di validazione.

Una nuova stretegia

Il nuovo test in fase di validazione, che ha attratto l’attenzione della comunità scientifica, è costituito da un sistema che ormai è sulla bocca di tutti, un sistema che solitamente regala grandi soddisfazioni e che proprio in questo anno è stato protagonista del premio Nobel per la chimica: CRISPR-CAS.

Agli inizi di ottobre è stato pubblicato in pre-print su MedRvix l’articolo scientifico recante tutte le informazioni dettagliate riguardanti l’elaborazione di questo nuovo test dove tra gli autori c’è proprio una delle madri di questa tecnica di ingegneria genetica nonché appunto premio nobel 2020 (Figura 1): Jennifer A. Doudna.

Come funziona

il test si basa sull’analisi di un campione nasale di un paziente, questa analisi viene effettuata andando a sfruttare il meccanismo di azione della CRISPR-Cas13. A molti lettori del settore e non, sembrerà strano parlare di Cas13, quasi sempre, in diverse ricerche scientifiche si è spesso parlato di Cas9, ma forse non tutti sanno che esistono diversi enzimi della famiglia Cas con attività essenzialmente diverse.

La Cas9 è quella più famosa in quanto rappresenta una forbice molecolare in grado di andare a clivare il Dna a doppio filamento, come quello umano, ed è proprio anche per questa sua caratteristica che è molto utilizzata in ricerca medica.

La Cas13 invece è in grado di tagliare l’RNA a singolo filamento, proprio come l’acido nucleico del nostro nemico SARS-coV-2.

Tecniche diagnostiche preesistenti

In realtà, questa non è la prima tecnica diagnostica che sfrutta l’azione di questo sistema, ad oggi ne esistono altre due: “SHERLOCK” e “DETECTER”, anche queste rese disponibili per la rilevazione del SARS-coV-2.

Queste due metodologie però, come scritto nell’articolo, hanno bisogno di una fase di pre-amplificazione del campione per l’identificazione del genoma virale e questo step comunque allunga i tempi della procedura e soprattutto i risultati devono comunque essere gestiti da strumentazioni all’interno di un laboratorio.

Caratteristiche fondamentali della nuova strategia

La nuova strategia di test rapido non ha bisogno di questa fase di pre-amplificazione ma solo di una soluzione di reagenti che vengono aggiunti al campione, senza nessun’altra manipolazione. Questa soluzione sarà caratterizzata da diversi protagonisti quali:

1. RNA guida (crRNA) ovvero quei filamenti di RNA in grado di riconoscere la sequenza target e guidare il taglio dell’enzima Cas (Figura 2). In particolare, per aumentare la sensibilità e specificità della metodica, ne sono stati inseriti tre in grado di andare a riconoscere i geni N (Nucleocapside) ed E del virus.
2. Cas13: in grado di tagliare l’RNA target identificato dagli crRNA.
3. Fluorofori e quencer: in grado, ad ogni taglio di rilasciare un segnale fluorescente. Questo segnale sarà tanto più intenso quanto più tagli si saranno effettuati e perciò ci darà non solo una risposta di positività o negatività del soggetto all’infezione, ma anche una misura quantitativa di copie del virus.

Tra le diverse combinazioni testate, questa sembra essere la più promettente in grado di andare a riconoscere fino ad un minimo di 100 copie virali per microlitro.

Il sistema è stato provato anche su campioni infetti da altri virus con caratteristiche genomiche simili al SARS-coV-2 come l’ Alphacoronavirus HCoV-NL63, il Betacoronaviruses HCoV-OC43, la Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) e l’H1N1, ma non ha mai dato segnale positivo, indicando una elevata specificità.

Torniamo ad un fattore importante, ovvero il fattore TEMPO.

Gli esperimenti mostrano come questo test rapido possa dare una risposta di positività o negatività già entro 5 minuti e che possa dare informazioni precise sulla carica virale (misura quantitativa) in 30 minuti.

Ma la cosa ancor più sbalorditiva di questa nuova strategia proposta è che per accorciare ancor di più questo famigerato fattore TEMPO, il team di ricercatori abbia creato un device portatile in grado di poter effettuare il test al di fuori di un normale laboratorio senza inficiare specificità e sensibilità di questo.

I vantaggi

Facendo una breve sintesi di questa nuova strategia, le chiavi di miglioramento quindi sono:

1. L’utilizzo di più RNA guida in grado di targettare diverse zone del genoma virale aumenta la sensibilità e specificità del test e soprattutto permette anche di avere una più alta possibilità di riconoscere il genoma virale anche qual’ora esso presentasse nuove mutazioni.
2. Il vantaggio di poter convertire direttamente un segnale fluorescente in copie virali.
3. Non ha fasi di pre-amplificazione
4. Tempi ridotti.
5. Possibilità di svolgere il test al di fuori dei laboratori evitando di intasarli e sovraccaricarli di lavoro.
6. Economico.

Questo test ad oggi è ancora in fase di validazione, se riuscisse a passare questa, potrà essere commercializzato. La speranza è tanta.

Siamo quindi arrivati anche alla fine di questo articolo, sperando che l’obiettivo prefissato al suo incipit sia stato mantenuto.

Ricordatevi però che anche questa confusione può avere un suo risvolto positivo, è frutto di una comunità scientifica che è in continuo fermento, che lavora giorno e notte per arrivare a risposte, scoperte, soluzioni che possano farci uscire il prima possibile da questa situazione.  

Ricordiamoci anche poi, che non è tutto solo nelle mani della comunità scientifica, ma anche nelle nostre.

Quindi con le vostre mani, accendete la lampada che possa illuminare la vostra mente in tutta questa confusione, informatevi sapientemente, da fonti attendibili, ragionate, siate prudenti e ricordatevi anche poi… di lavarle.

Ilaria Bellini

FONTI

• https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.09.28.20201947v1