Clotianidina: il pesticida degradato dall'Apis mellifera.

È noto ed innegabile che i neosintetizzati chimici, in agronomia, abbiano largamente agevolato le pratiche di salvaguardia delle colture alimentari, dai numerosi e disparati attacchi di infestanti. Questo ha portato ad una conseguente crescita esponenziale della produttività mondiale. Tuttavia, il costo ecologico globale di tali dotazioni sferzanti i microequilibri funzionali delle infinite reti trofiche è un peccato che, già da decenni, scontiamo oziosamente. Non vi è mente umana, infatti, che non contempli l’astratto allarme di scomparsa dell’Apis mellifera (Fig. 1), per avvelenamento secondario da pesticidi. E, pur pesticida ubiquitario, la clotianidina potrebbe essere molecola alla portata dei lenti ma efficaci processi di degradazione delle care api.

Apis mellifera potrebbe degradare il pesticida clotianidina. Grazie a ceppi probiorici del suo microbiota enterico. — *Figura 1 – Apis mellifera. Fonte [libriomeopatia].*

Le nostre scellerate turbative chimico-fisiche, in fondo, pesano anche per la rapidità del passo con cui piombano sui lungamente perfezionati ingranaggi enzimatici e molecolari degli organismi di ogni ordine, grado e famiglia. I cui regimi di reazione, e adattamento, si attestano invece su lente logiche di stabile longevità. Alleanze microbiche, qui, volte alla sana sopravvivenza dell’ospite, anche negli imenotteri, non mancano. Un microbiota d’ape, che può far la differenza tra la vita e l’estinzione di massa.

Storia di una dabbenaggine. Clotianidina, creduta scampo dall’inferno degli organofosfati.

Organofosfati. Carbammati. Piretroidi. Le tre teste del Cerbero agronomico degli anni Cinquanta. Da questo monstrum si è cercato scampo. Nel 1978, Shell scoprì che la nitiazina, derivato della 1,3-tiazina con gruppo nitrometilenico, avesse forti attitudini insetticide, fondate sull’agonismo della tal molecola con l’acetilcolina, neurotrasmettitore centrale e periferico di ogni organismo vivente e moneta di scambio tra impulsi nervosi ed azioni sistemiche. Si tratta, dunque, da allora, di una lotta per il recettore, nell’insetto nemico; recettore, preposto alla mansiòn di serratura; acetilcolina e nitiazina, in vesti l’uno di chiave, l’altra di grimaldello.

La sola instabilità alla luce della molecola appena sintetizzata scombinò però i piani di produzione e diffusione sul mercato, con un ultimo tentativo fallimentare di conversione in omologo stabile formilato. Dalla mancata soluzione, intanto, Nihon Tokushu Noyaku Seizo K.K. (Nihon Bayer Agrochem) ne cavò l’imidacloprid, bis-eterociclico alogenato strutturalmente simile alla nicotina, che inaugurò l’epoca dei pesticidi nicotinici. Funzione ed efficacia contro gli Hemiptera. Commercializzato nel 1991.

Da allora la ricerca chimica ha di molto accelerato lo studio di nuove formule pesticide: ne sono derivati, infatti, almeno 6 diversi insetticidi, tutti a base di clotianidina. Tutti insieme definiti neonicotinoidi: nitenpyram, acetamiprid, thiamethoxam, thiacloprid, ed infine clotianidina e dinotefuran.

Clotianidina: fatti e misfatti

Il pesticida mostra notevole efficacia biologica, già in piccole aliquote, con in più un temibile ampio spettro d’azione (Fig. 2). Già. Così ampio, lo spettro, che oltre agli infestanti delle famiglie Hemiptera, Thysonoptera, Coleoptera, Lepidoptera e Diptera, la clotianidina agendo da agonista grimaldello sui recettori nicotinici per l’acetilcolina (nAChRs), causa disordini neurologici anche nella famiglia Hymenoptera. E dunque, l’Apis mellifera. Ma non solo.

Apis mellifera potrebbe degradare il pesticida clotianidina. Grazie ai probiotici del loro microbiota enterico. — *Figura 2 – Insetti target del pesticida clotianidina. Fonte [semanticscholar].*

Perché, infatti, dopo decenni di sereno impiego, come garantito innocuo rimedio selettivo, ed intelligente, ci ritroviamo oggi a dover fronteggiare una persistenza ubiquitaria che non risparmia suolo, acque e colonie di impollinatori, senza i quali la produzione alimentare sarà un certosino lavoro di mimesis, del bel ronzante peregrinàr del tempo che fu; dall’impegno tecnico, inoltre, e manuale, a dir poco sfiancante; e dai costi delle merci da ultimi sopravvissuti, alla «Make Room! Make Room!» di Harry Harrison.

Apis mellifera dalle mille risorse

Tanto per cominciare, le mellifere vestali dei nostri templi alimentari svelano un succinto ma idoneo corredo genetico, in grado di codificare per enzimi inattivanti i pesticidi. E questo nonostante, di fatto, il loro sistema di detossificazione sociale e la loro immunità collettiva siano in grado di compensare solo un breve elenco di tossici. Inoltre, secondo ulteriori studi condotti da Simone Tosi e colleghi, sperimentali supplementazioni nutritive, negli insetti, di nettare e polline, indurrebbero miglior resistenza ai pesticidi, nel genere Apis spp. E lo studio di Mao, intanto, confermerebbe anche tale invigorimento degli impollinatori, puntualizzando il motivo, con l’up-regolazione genica: stimolazione genica, cioè, su base nutrizionale; in grado di innalzare i livelli enzimatici competenti in detossificazione dal pesticida.

Di più. Negli ultimi lavori sul tema della detossificazione ambientale, microbi in forma di batteri e funghi, si sono dimostrati fautori di degradazione dei composti nocivi, immessi nel sistema ecologico dai pesticidi. I batteri Acinetobacter, Actinomycetes, Bacillus, Mycobacterium, Pseudomonas, Pseudoxanthomonas, Rhizobium, Rhodococcus, Sphingomonas; ed i funghi Aspergillus, Fusarium e Stenotrophomonas. Tutti capaci di metabolizzare pesticidi neonicotinoidi; ed in dettaglio, microbi ambientali hanno espresso tale benefica facoltà nei confronti della clotianidina. Si tratta di Pseudomonas e di Phanerochaete sordida. Essi, in grazia delle individuali caratteristiche metaboliche delle vie degradative, possono produrre, dal pesticida, metaboliti meno od anche più tossici. Assurgendo quindi a veri e propri regolatori degli equilibri ambientali.

Come riflesso intrinseco del cosmo microbico esterno, i residenti del microbiota nell’intestino d’ape hanno anch’essi ruolo cruciale nella resistenza al silenzioso sterminio collaterale. Finora però ancora poco esplorato, il pool probiotico anti-clotianidina.

Gli endogeni ceppi batterici d’Apis mellifera: degradatori del pesticida

Tra l’estate 2015 e l’inverno 2016, i ricercatori guidati da Sarah El Khoury hanno dunque condotto isolamento di alcuni potenziali probiotici presenti nell’intestino d’ape. Gli esemplari adulti di Apis mellifera provenivano da colonie europee; 60 individui adulti, in particolare, prelevati dal Centre de Recherche en Sciences Animales di Deschambault (CRSAD, Québec, QC, Canada).

Cronache di una dissezione annunciata, ovvero: isolamento e caratterizzazione dei ceppi microbici

In condizioni di sterilità i ricercatori hanno provveduto all’estrazione dei singoli intestini degli esemplari adulti di Apis mellifera; li hanno posti a macerare, passati in vortex, quindi stemperati in 10 mL di PBS sterile (1X). Ne hanno, poi, tratto delle diluizioni di ordini da 10⁻¹ a 10⁻⁴ , contenenti tessuto enterico degli insetti. Di ognuna di queste diluizioni, gli operatori hanno trasferito 100 µL su terreno solido TSA, consentendo poi l’incubazione al buio, per 48 ore, in aerobiosi ed a temperatura di 37°C. Trascorsi i due giorni, ecco l’isolamento delle colonie dal mezzo di crescita. Ogni CFU, quindi, è stata ripassata su nuove piastre di TSA, per fase canonica di prima purificazione, così alla grossa.

Ceppi endogeni d’ape e loro capacità di crescita, nonostante la clotianidina

La di prammatica successione di eventi sperimentali correla poi l’isolamento microbico all’estrazione del relativo materiale genetico; con conclusivo confronto di sequenza, a mezzo allineamento BLAST, su database NCBI. Da tutto ciò emergono 7 ceppi: Edwardsiella spp., due specie di Serratia (Serratia sp.1 e Serratia sp.2), Rahnella spp., Pantoea spp., Hafnia spp. ed Enterobacter spp.

Saggio di crescita dei probiotici enterici di Apis mellifera

Ogni CFU precedentemente identificata, dunque, è stata trasferita in terreno liquido TSB, sotto agitazione (180 rpm), quindi lasciata in incubazione buia, per 48 ore, a temperatura di 37°C; fino a congrua crescita. La soluzione di probiotici così ottenuta ha poi subìto calibrazione spettrofotometrica: portata, cioè, a finale concentrazione cellulare di 1 O.D. (Optical Density), a 600 nm. Prelevati 100 µL di ogni soluzione, i ricercatori hanno accostato i ceppi al pesticida mediante centrifugazione, sedimentazione e risospensione in altrettanti microlitri di PBS (1X).

Per far questo, essi hanno prelevato 10 µL di ciascuna coltura cellulare microbica, trasferendola poi in micropiastre a nido d’ape, recanti tre aliquote crescenti di clotianidina: 0.5, 1 e 10 ppb. Il tutto quindi in triplicato, come in triplicato sono stati allestiti i controlli: l’uno, 200 µL del mezzo di crescita liquido; l’altro composto d’ogni ceppo microbico ( 10 µL, ad 1 O.D. ) e 190 µL di TSB.

Mediante lettore di piastre Bioscreen-C, i ricercatori hanno poi quantificato le attitudini di resistente crescita cellulare, in condizioni di tossicità chimica da pesticida. Le piastre, intanto, poste in incubazione al buio, per 72 ore, alla stessa temperatura di 37°C; avendo cura di registrare i valori cangianti di O.D., ogni 15 minuti. Comprensibilmente, tipo e mole di tali dati temporali sono finiti su funzionali grafici, descrittori di curve di crescita differenziali; con tanto di Test Shapiro-Wilk, a consentire la corretta assunzione di normalità; per ogni singolo ceppo.

Divergenze di crescita sotto influsso pesticida

Sulla base di una doppia interazione tra trattamenti e sovracrescita overtime, i risultati ottenuti restituiscono differenze di reazione cellulare, espressa in variazioni del tasso di crescita, tra i potenziali probiotici enterici di Apis mellifera. Tutti i ceppi intestinali sono risultati in grado di crescere su TSB; sia scevro da insetticida sia infarcito delle tre differenti aliquote tossiche.

In particolare, il tasso di crescita differisce solo per Hafnia spp. ed Enterobacter spp., ma anche tra loro, con sensibili distinguo. La clotianidina si dimostrerebbe, infatti, secondo i dati sperimentali, finanche benefica promotrice di crescita per il ceppo Hafnia sp.; del quale non si può che registrare un incremento duplicato di O.D., durante il periodo di incubazione. Enterobacter spp., invece, fa osservare un sensibile decremento di crescita sana, già in presenza della più piccola aliquota di pesticida, ovvero 0.5 ppb.

Tale minima concentrazione chimica, infatti, ha dimostrato un impatto persino più intenso sulla crescita dei ceppi da microbiota enterico d’ape, secondo un ordine decrescente: Edwardsiella spp., Serratia spp.1, Rahnella spp., Hafnia spp., Enterobacter spp. e Pantoea spp.; il tasso di crescita di Pantoea spp. è il più prono alla pur minore concentrazione di pesticida, durante tutto l’esperimento. A differenza di Edwardsiella spp., Serratia spp.1, Rahnella spp. ed Hafnia spp.

A concentrazioni di 1 e 10 ppb di clotianidina, invece, l’effetto d’incidenza sulla crescita microbica, in ordine decrescente, è: Serratia spp.1, Edwardsiella spp., Enterobacter spp., Rahnella spp., Hafnia spp. e Pantoea spp.

Anche in queste concentrazioni insetticide, Pantoea spp. è il ceppo dalla crescita più ostacolata; ma mentre a concentrazione tossica di 1 ppb e 10 ppb di clotianidina, esso differisce particolarmente da Edwardsiella spp., Serratia spp.1, Hafnia spp. ed Enterobacter spp., ad 1 ppb Pantoea spp. differisce solo da Rahnella spp.

Dalla resistenza al contrattacco: la bioremediation dell’Apis mellifera

In vitro, i ricercatori hanno valutato non solo le strenue resistenze dei ceppi probiotici del microbiota di Apis mellifera, al tormento tossico del pesticida clotianidina, ma hanno anche sondato la cruciale inattesa risposta degradativa di tali ceppi.

Dalla quantificazione ottenuta mediante tecnica a tamdem di cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS/MS), le prove probiotiche hanno rivelato che a poter effettivamente degradare l’aliquota minima di clotianidina, siano il ceppo Serratia spp.1, Rahnella spp. e Edwardsiella spp. al tempo T48. Quindi dopo 48 ore dall’inizio dell’esposizione chimica. Trascorse 72 ore, invece, si è osservato un sollevante 100% di concentrazione di clotianidina degradata dai 7 ceppi probiotici del microbiota d’ape.

Siglare nuovi pacifici equilibri, incontrandosi a metà strada

La clotianidina, dunque, a fronte di un inatteso incentivo di crescita del ceppo Hafnia spp., procura, anche a dosi sub-letali, differenti gradi di disbiosi intestinale nelle preziose api mellifere; esponendole con ciò a tutti i disordini metabolici e neurologici che ben temiamo e dobbiam temere in vista di una ferale perdita d’impollinazione naturale.

Per i ricercatori, risulta interessante, dunque, valutare in un imminente futuro le capacità degradative celate nei dorati insetti di dosi pesticide più elevate; al solo scopo speculativo ci auguriamo. Perché, se non riuscissimo, neppure adesso, a stringer nuovi accordi di sensata quietanza con le laboriose difese microbiche e metaboliche degli impollinatori, rinunciando alle pretese chimiche e rientrando nelle logiche biologiche, non avremmo più diritto neppure all’angustia.