La nitroreduttasi, un enzima batterico per la generazione di modelli animali

Nitroreduttasi

Le nitroreduttasi sono una famiglia di proteine di natura enzimatica. Si trovano principalmente nei batteri, sebbene siano stati identificati anche numerosi omologhi eucariotici. I membri di questa famiglia includono la nitroreduttasi NAD(P)H e la NADH deidrogenasi. Alcune di queste proteine sono descritte come ossidoreduttasi.

Catalizzano una reazione che comporta la riduzione da nitrato a nitrito. Attraverso una catena di trasferimento elettronico, due elettroni sono trasferiti dal NADH al nitrato, che diventa, appunto, nitrito. La reazione catalizzata è riportata di seguito:

nitrito + NAD⁺ + H2O ⇄ nitrato + NADH + H⁺

A livello fisiologico, questi enzimi sono di fondamentale importanza perché catalizzano una vasta gamma di processi redox. Negli ultimi anni si è trovato il modo di sfruttare tale capacità in diversi modi. Ad esempio, la nitroreduttasi è stata recentemente utilizzata con successo come gene della terapia suicida per la terapia del cancro. Essa si associa al CB1954 come substrato (profarmaco), che in seguito alla riduzione diventa un agente alchilante altamente citotossico.

In questo articolo ci vogliamo soffermare sull’uso di questo enzima per la generazione di modelli animali, in particolare del modello zebrafish, fondamentali per lo studio di innumerevoli patologie e per la comprensione dei meccanismi che ne sono alla base.

Il modello zebrafish

Il pesce zebra (Danio rerio) è un piccolo pesce d’acqua dolce. Deve il suo nome alle strisce che corrono lungo il suo corpo. Già da alcuni anni questi pesci ossei vengono utilizzati come organismi modello nella ricerca biomedica. La capacità di indurre danno con precisione in cellule e tessuti di questo organismo modello, grazie proprio all’utilizzo della nitroreduttasi, ha aperto nuove strade negli studi su sviluppo, malattie e rigenerazione.

Figura 2 - Il pesce zebra, con le caratteristiche strisce da cui prende il nome. Fonte: https://en.wikipedia.org/wiki/Zebrafish — *Figura 2 – Il pesce zebra, con le caratteristiche strisce da cui prende il nome. Fonte:* https://en.wikipedia.org/wiki/Zebrafish

Ci sono molte caratteristiche che rendono questi animali adatti alle sperimentazioni. Innanzitutto, si riproducono rapidamente e possono generare un gran numero di prole. Sono semplici da curare e meno costosi da mantenere rispetto ad altri modelli di vertebrati. Hanno un alto grado di conservazione genetica con vertebrati più elevati, compresi gli esseri umani. Nelle prime fasi dello sviluppo (prima di 5 giorni dopo la fecondazione) avvertono poco o nessun dolore e non sono quindi protetti dal regolamento sulla sperimentazione animale. Lo sviluppo degli embrioni avviene all’esterno, rendendo particolarmente agevole la manipolazione dell’espressione genica attraverso tecniche di microiniezione. Queste permettono di studiare la funzione di specifici geni e le conseguenze della loro assenza o modificazione. I loro geni possono anche essere regolati farmacologicamente aggiungendo sostanze al mezzo acquoso in cui vivono.

Nel contesto del nostro articolo sulla nitroreduttasi, è proprio quest’ultimo punto quello per noi di maggiore interesse.

Nitroreduttasi e metronidazolo

La nitroreduttasi batterica di Escherichia coli è in grado di convertire il profarmaco non tossico metronidazolo in un metabolita citotossico. Inizialmente, il NADH o il NADPH riducono la nitroreduttasi. Quindi, il metronidazolo si lega alla nitroreduttasi, viene ridotto e convertito in un potente agente capace di creare danni a livello del DNA. Nei pesci zebra transgenici, la nitroreduttasi è espressa sotto un promotore tessuto-specifico. L’ aggiunta di metronidazolo nel mezzo in cui sono allevati i pesci induce la morte esclusivamente delle cellule che esprimono la nitroreduttasi.

Figura 3 - Schematizzazione del funzionamento del sistema nitroreduttasi-metronidazolo. Il metronidazolo induce la morte esclusivamente delle cellule che esprimono la nitroreduttasi. Fonte: https://ackerleylab.com — *Figura 3 – Schematizzazione del funzionamento del sistema nitroreduttasi-metronidazolo. Il metronidazolo induce la morte esclusivamente delle cellule che esprimono la nitroreduttasi.* *Fonte:* https://ackerleylab.com

Il vantaggio principale di questa tecnica è che la forma tossica del farmaco danneggia solo le cellule che esprimono l’enzima. Essa non colpisce invece le cellule vicine. Inoltre, la fusione di un tag fluorescente con la nitroreduttasi consente di monitorare il destino delle cellule che esprimono l’enzima durante tutto il corso dell’ablazione.

Applicazioni dell’ablazione mediata da nitroreduttasi/metronidazolo

Questa tecnica ha molteplici applicazioni. L’esame degli effetti dell’assenza di un tessuto o di una popolazione cellulare può, ad esempio, fornire nuove informazioni sulla comprensione del ruolo di quel tessuto o di quella popolazione cellulare. Tali informazioni aiutano a comprendere i meccanismi coinvolti durante lo sviluppo o l’omeostasi. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato come strumento versatile per studi di rigenerazione: l’analisi del recupero tissutale dopo l’ablazione consente di chiarire i meccanismi cellulari e molecolari alla base della rigenerazione del tessuto.

Questo approccio può essere utilizzato sia in esemplari di zebrafish wild-type (in cui non sono indotte mutazioni) sia in individui mutati o geneticamente modificati. Ricerche scientifiche hanno dimostrato il successo dell’ablazione di cardiomiociti, epatociti, podociti e cellule β pancreatiche in embrioni e larve di pesce zebra utilizzando promotori specifici per ciascuna di queste popolazioni cellulari. Questi studi hanno anche dimostrato che la tecnica di ablazione cellulare nitroreduttasi/metronidazolo è reversibile, poiché è possibile osservare il recupero dei tessuti dopo l’ablazione.

Sviluppo di un modello di FSGS

Il sistema nitroreduttasi/metronidazolo permette inoltre di sviluppare dei modelli specifici di patologie. Un esempio che possiamo riportare è quello della generazione di un modello simile alla malattia renale definita glomerulosclerosi focale segmentale (FSGS). Essa si manifesta inizialmente con una lesione a livello del glomerulo renale. Continua poi con la deplezione dei podociti, cellule i cui prolungamenti (processi del piede) si interdigitano sui capillari glomerulari, contribuendo al corretto funzionamento della barriera di filtrazione glomerulare.

La deplezione dei podociti, indotta mediante il sistema nitroreduttasi/metronidazolo, in un ceppo transgenico di zebrafish risulta in un danno glomerulare con caratteristiche molto simili a quelle dell’ FSGS negli umani:

riduzione della funzionalità della barriera di filtrazione
insorgenza di proteinuria
perdita della caratteristica interdigitazione dei processi del piede dei podociti.

La similarità tra gli effetti indotti dal sistema nitroreduttasi/metronidazolo nel glomerulo renale di zebrafish e le caratteristiche della malattia negli umani conferma che questo organismo modello così generato può effettivamente essere usato per studiare la glomerulosclerosi focale segmentale in vivo.

Nifurpirinolo come sostituto del metronidazolo

Questo sistema presenta tuttavia un limite notevole: una certa variabilità nell’efficienza dell’ablazione con il profarmaco metronidazolo. Ciò ha spinto gli scienziati a cercare un composto più efficiente e affidabile. Nel 2018 un gruppo di ricercatori ha proposto il nifurpirinolo, un altro antibiotico nitroaromatico, come profarmaco più potente rispetto al metronidazolo per innescare l’ablazione cellulare nei modelli transgenici che esprimono la nitroreduttasi.

Figura 4 - Struttura chimica del nifurpirinolo. Fonte: https://www.pharmawiki.ch — *Figura 4 – Struttura chimica del nifurpirinolo. Fonte:* https://www.pharmawiki.ch

Essi hanno dimostrato che il nifurpirinolo induce ablazioni robuste e affidabili a concentrazioni 2.000 volte inferiori rispetto a quelle del metronidazolo e tre volte al di sotto della propria concentrazione tossica. E’ stata osservata l’efficienza del nifurpirinolo nell’innescare l’ablazione massiccia di tre diversi tipi cellulari: le cellule beta del pancreas, gli osteoblasti ei neuroni dopaminergici. Questi risultati suggeriscono che il suo uso potrebbe essere esteso a molti altri tipi cellulari, rendendolo un perfetto sostituto del metronidazolo.