Ureasi microbiche: dai suoli d’Etiopia, enzimi versatili

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L’Etiopia dispiega scenari ambientali dagli stranianti contrasti cromatici. Solcati dalla Rift Valley e punteggiati di laghi acidi, vulcanici, i suoli di questa regione dell’Africa hanno appena svelato d’essere anche ottime fonti di batteri produttori di ureasi microbiche. Enzimi, questi, pronti ad accordarsi alle più disparate esigenze tecnologiche umane.

Da culla dell’umanità a fonte di ureasi microbiche: l’Etiopia

Culla dell’umanità, sì. Per i notissimi, e copiosi, ritrovamenti fossili, testimoni minerali dell’intera storia evolutiva degli ominidi: ardipitechi, australopitechi (la cara Lucy, reperto A.L. 288), esemplari del genere Homo (habilis, erectus, sapiens). La Rift Valley etiope (figura 1) è un sito cruciale, quindi, per la ricerca paleontologica umana. E come potrebbe non esserlo. L’attività vulcanica e quella tettonica, responsabili entrambe della formazione di depressioni, valli lineari, che si estendono per migliaia di chilometri, e la contemporanea sedimentazione hanno nell’insieme instaurato condizioni ideali per il fiorire della vita. Le ceneri vulcaniche, i sedimenti vulcanoclastici e le colate laviche, poi, hanno fatto il resto: ricoprendo, cristallizzando e custodendo un nutrito museo botanico e zoologico.

Eduard Suess (figura 2), geologo austriaco, nel 1891 fu il primo a comprendere che le spettacolari valli sprofondate, delimitate da solchi paralleli, fossero esiti di “forze tensionali (crostali) dirette perpendicolarmente alle spaccature”. Nel 1894, poi, John Walter Gregory (figura 3) coniò, traducendo di fatto il predecessore, l’iconico nome di Rift, frattura. E questo solco, strappo o cesura si allarga ancor oggi, progressivamente e inesorabilmente, nel tempo: lacera l’antico continente nella sua porzione più orientale.

Fermento di vite umane e microbiche

Come fatale cifra geo-antropologica del luogo, la frattura si insinua nei rapporti umani, tra le comunità, tanto da riaffiorare persino nei versi omerici dell’Iliade e dell’Odissea: quegli Αἰθίοπες, « visi bruciati », dalla pelle bruna, divisi in popolo d’Occidente e popolo d’Oriente. E ancora Erodoto, nelle Storie (VII, 70), separa fenotipicamente gli etiopi orientali, dai capelli lisci, da quelli occidentali, con capelli crespi.

Di certo, gli eredi del trono dei Salomonidi sono tuttora un fragile mosaico di etnie, lingue, comunità, religioni, che rischia, proprio in queste settimane, di frammentarsi ulteriormente e geopoliticamente “tra gli affondi e le stoccate furiose, di potenti avversari“, per Shakespeare: l’esercito federale del Primo Ministro Abiy Ahmed, contro i tigrini del Fronte di Liberazione del Tigrai.

Ci sono luoghi, evidentemente, di questo azzurro e rotondo Prodigio, in cui il tormentoso fermento umano fa riverbero, nel brulicare inafferrabile degli altri Regni Naturali. Quello dei Monera, per esempio, che accoglie i Batteri, ha riservato ai ricercatori, in Etiopia, l’inedita microbica sorpresa.

Enzimi ricercatissimi nei suoli a cavallo della Rift Valley

Alcuni storici riferimenti sperimentali attestano che i microrganismi produttori di ureasi, in grado di idrolizzare l’urea, siano rappresentati da esemplari aerofili, microaerofili ed anaerobi. L’ipotesi di isolamento di ceppi ambientali, per l’impiego in future applicazioni, pure è già stata esplorata. Ma lo studio, da poco pubblicato, è il primo ad occuparsi di individuazione, isolamento e caratterizzazione di tali batteri, in suoli d’Etiopia, dalla variegata pedografia.

Ureasi: proteine enzimatiche microbiche

L’ureasi è un enzima che regola, e consente, la scissione dell’urea, noto prodotto del catabolismo comune a piante, alghe, batteri e funghi. Per questo, l’attività ureasica è largamente diffusa nei suoli. Ma ben più famoso è il suo ruolo come fattore di virulenza, responsabile della formazione di calcoli urinari, insorgenza di pielonefriti ed ulcerazioni gastriche.

Parte integrante di biosensori medicali, per la misurazione dell’urea in sistemi a flusso, ma anche di processi di fertilizzazione dei suoli, per idrolisi dello ione ammonio, negli ultimi 20 anni, le ureasi microbiche hanno valicato i confini dell’agronomia e della rilevanza clinica, per raggiungere l’ingegneria geotecnica e le biotecnologie applicate. E questo grazie alla precisa abilità dei microrganismi di favorire, con i loro enzimi, la precipitazione della calcite, comune agente naturale cementante del suolo.

Stati delle ureasi e fonti microbiche degli enzimi nei suoli

A produrre i versatili enzimi ci pensano, in realtà, numerosi stipiti batterici: Proteus, Morganella, Serratia, Pseudomonas, Clostridium, Fusobacterium, Ureaplasma, Providencia, Sarcina, Lactobacillus, Streptococcus, Enterobacter. L’intervento delle ureasi comporta, così, la trasformazione di una molecola neutra in due ioni, elettricamente carichi: NH4+ e CO32− . Proprio la presenza di NH4+ , innalzando il pH del mezzo, avvia la precipitazione del carbonato di calcio.

Le ureasi microbiche, negli stati intra- ed extracellulari, ed i loro batteri produttori sono ricercati anche per la capacità di strutturare complessi bioenzimatici, in grado, per esempio, di stabilizzare l’argilla espansa.

Enzimi nei suoli d’Etiopia: lo studio

Il gruppo di ricerca, guidato da Eshetu Mekonnen, ha provveduto al campionamento di terreno delle zone limitrofe alla Rift Valley, e precisamente:

  • fabbrica di fertilizzanti di Tulu Bolo,
  • suolo presso la riva del lago Abijata, e del lago Chitu,
  • termitai nell’area di Wonji, della città di Yabello, e nel West Wollega.

I campioni omogenati hanno poi rappresentato unità di matrici multiple, previo prelievo dai primi 10 cm di profondità, dalla superficie dei suoli interessati (a mezzo spatole e sacchetti in polietilene, sterili).

Arricchimento delle fonti microbiche di ureasi

Per incrementare le popolazioni batteriche produttrici di ureasi, i ricercatori hanno quindi seminato 1 g di ogni campione di terreno in 100 mL di specifico mezzo di coltura liquido (Urea Broth, 6% urea w/w), ed avviato l’incubazione in aerobiosi a 30°C, sotto agitazione costante (130 rpm), per 120 ore. Per sicurezza, una ulteriore implementazione di popolazioni microbiche, i ricercatori l’hanno ottenuta con ripetuti trasferimenti colturali dei campioni in freschi mezzi di crescita.

L’isolamento dei ceppi batterici ha poi richiesto serie di diluizioni e piastramenti su agar con urea, in aerobiosi e a 30°C, per 24 ore. Solo le colonie che nel mezzo solido hanno manifestato alti potenziali d’idrolisi dell’urea sono state poi purificate in ulteriori, omologhi, passaggi di semina su piastra. La valutazione visiva ha infine consentito di apprezzare un viraggio cromatico del mezzo di coltura, dal giallo pallido al rosso. Di 153 colonie iniziali, hanno preseguito la sperimentazione solo in 20.

Saggio quantitativo di attività ureasica

La produzione di molecole cariche, in seguito all’idrolisi dell’urea, ha permesso quindi, ai ricercatori, di registrare una quota di conduttività, riportata poi in un grafico di interpolazione dei dati, rispetto al tempo. Così essi hanno ottenuto le percentuali di variabilità della conduttività, per poi moltiplicarle per i fattori di diluizione, raggiunti nelle precedenti fasi sperimentali.

Da tutto ciò, l’Attività Ureasica Specifica (mM urea idrolizzata/min/OD) è derivata dal rapporto tra l’Attività Ureasica (mM urea idrolizzata/min) e Biomassa Batterica a OD600 (densità ottica, misurata spettrofotometricamente a 600 nm).

Identificazione e caratterizzazione dei migliori produttori di ureasi microbiche

La prassi sperimentale è poi proseguita ben spedìta: analisi della morfologia delle colonie, amplificazione genica di RNA 16S, sequenziamento ed analisi nucleotidica, da un lato; ottimizzazione dei parametri colturali e registrazione dei rispettivi connotati biochimici dei ceppi batterici dall’altro. Tutto per conseguire l’analisi filogenetica che profilasse nitidamente l’identità dei produttori di ureasi microbiche, oggetto delle molte mire applicative.

La voce dell’RNA 16 S ha di fatto scandito una similarità di sequenza genica del 98.6%, attribuendo ad un 15% dei campioni genomici l’identità di Bacillus, ad un altro 15% quella di Citrobacter, ed al restante 70% l’esito di configurarsi Enterobacter.

Gli optima dei migliori isolati: pH, temperatura, salinità

I risultati del saggio d’Attività Ureasica Specifica (mM urea idrolizzata/min/OD) mettono in luce l’efficienza di tre isolati, Isolato_3, Isolato_7 ed Isolato_11, con i rispettivi valori: 3.88 mM/min/OD, 3.18 mM/min/OD, 3.05 mM/min/OD.

A tali identificativi sperimentali, l’analisi filogenetica consegna, poi, le specificazioni in:

  • Bacillus paramycoides MCCC 1A04098T (Isolato_3);
  • Citrobacter sedlakii I-75T (Isolato_7);
  • Enterobacter bugandensis 247BMCT (Isolato_11).

Dai suoli di crescita alle future colture industriali: i batteri, produttori d’enzimi, avranno precise esigenze

Crescite microbiche, del 100%, i ricercatori le hanno registrate ai seguenti valori di pH, nei suoli analizzati:

  • Enterobacter bugandensis, a pH 7.0;
  • Citrobacter sedlakii, a pH 8.0;
  • Bacillus paramycoides, a pH 7.4 .

Lo studio delle OD, inoltre, ha consegnato nelle mani dei tecnici, dopo 24 ore di incubazione, valori ottimali di temperatura di crescita pari a:

  • 35°C, per Enterobacter bugandensis (incapace di crescita, tra 4-15°C);
  • 30°C, per Citrobacter sedlakii (in crescita ridotta o assente, tra 4-25°C, ed a 35°C);
  • 35-40°C, per Bacillus paramycoides (in crescita limitatissima o assente, tra 4-20°C, ed a 45°C).

Il grado di salinità, tollerabile per i tre ceppi batterici, infine, in percentuali è di:

  • 0.25% di NaCl, per Enterobacter bugandensis (capace, tuttavia, di crescita anche a concentrazioni saline pari o superiori al 10%);
  • 0.25% di NaCl, anche per Citrobacter sedlakii e Bacillus paramycoides (ma incapaci di crescita a valori, di salinità ambientale, pari o superiori al 10%).

Enzimi esogeni dei batteri produttori di ureasi nei suoli etiopi

Caratterizzazione complementare e conclusiva, dello studio, quella del profilo esoenzimatico dei ceppi, che consegna abilità biochimiche condivise tra le specie batteriche: attività peptidasica, nitrato-reduttasica, ed attività enzimatica correlata a composti contenenti fosfato. Sempre in comune anche l’assorbimento, per le specie microbiche, di D-maltosio, gluconato di potassio, sodio citrato ed N-acetil-glucosamina.

Citrobacter sedlakii e Bacillus paramycoides esprimono anche buona reattività ai lipidi in reazioni di esterificazione, mentre Enterobacter bugandensis e Citrobacter sedlakii condividono l’attività enzimatica di tripsina e β-galattosidasi. Attività enzimatica correlata agli zuccheri, invece, si attesta solo in Enterobacter bugandensis.

Come sempre, ogni gruppo di ricerca illumina un tratto di strada, sul lungo tragitto, che conduce al quasi completo discernimento, o all’impiego concreto di un agente biologico. Quindi, adesso, si passa il testimone.

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