FRET: trasferimento di energia per risonanza

Il FRET (dall’inglese, Fluorescence Resonance Energy Transfer, o in italiano, Trasferimento di Energia per Risonanza), è un meccanismo di trasferimento di energia tra fluorofori ampiamente utilizzato negli esperimenti biologici, in cui è spesso combinato con altre tecniche biochimiche per ottenere informazioni dettagliate sulle strutture e le interazioni biomolecolari.

Principio del FRET

Il FRET si basa sul trasferimento di energia da un fluoroforo (che agisce da donatore) ad un altro (che funge da accettore) attraverso un’interazione dipolo-dipolo.

In particolare, il donatore viene eccitato ad una specifica lunghezza d’onda e successivamente emette energia, la quale può quindi essere trasferita all’accettore, che emette a sua volta una fluorescenza che può essere rilevata (Figura 1).

*Figura 1: Esempio di due fluorofori prima (a) che si verifichi FRET, e dopo (b)*. [Optoprim-microscopie.com]

Per avvenire in maniera ottimale, il fenomeno FRET necessita che i due fluorofori utilizzati si trovino a breve distanza l’uno dall’altro: infatti, la quantità di energia trasferita (e quindi la fluorescenza rilevabile dall’operatore) dipende dalla vicinanza della coppia accettore-donatore, che è tipicamente nell’ordine delle decine di ångström (1 Å = 10^-10 m).

L’efficienza (E) di un processo di FRET dipende infatti dalla distanza tra donatore e accettore (r) secondo la legge riportata nella Figura 2. Un altro parametro da considerare è R₀, che invece corrisponde alla distanza critica di Förster, un parametro legato alle particolari caratteristiche della coppia di fluorofori e che indica la distanza alla quale l’efficienza del fenomeno FRET è pari al 50% (Figura 2).

Efficienza di FRET, dove E = efficienza, r = distanza fra donatore e accettore, e R0 = distanza critica di Förster — *Figura 2: Efficienza di FRET, dove E = efficienza, r = distanza fra donatore e accettore, e R₀ = distanza critica di Förster* [http://goldbook.iupac.org/FT07381.html]

Requisiti

Gli spettri di assorbimento del fluoroforo donatore e dell’accettore devono sovrapporsi in maniera significativa (>30%), altrimenti non si verificherebbe trasferimento di energia (Figura 3);
Al contrario, i due spettri di emissione dei fluorofori utilizzati non devono sovrapporsi, altrimenti la rilevazione dell’emissione di fluorescenza da parte dell’accettore non sarebbe chiaramente distinguibile dall’emissione del donatore (Figura 3);

*Figura 3: Esempio di spettri di emissione e assorbimento di due fluorofori tra cui si verifica FRET*
[Sciencedirect.com]

Inoltre, è fondamentale che i due spettri del donatore (di assorbimento e di emissione) non siano sovrapponibili affinché non si verifichino fenomeni di auto-trasferimento di energia tra diverse molecole di donatore;

È preferibile lavorare con una concentrazione limitata di fluoroforo donatore ed una molto maggiore di accettore.

I fluorofori più frequentemente utilizzati per il FRET appartengono alla famiglia della GFP (Green Fluorescent Protein). Esistono molte varianti della GFP, ciascuna ingrado di emettere fluorescenza di colori diversi. In particolare, la GFP emette nel verde, RFP emette nel rosso, BFP e CFP nel blu, e YFP nel giallo.

Applicazioni

Questo processo fisico può avere diverse applicazioni, tra cui troviamo per esempio:

Il rilevamento dell’ibridazione tra molecole di DNA (che può essere eseguito sia in vitro che in vivo, grazie all’utilizzo di microscopi a fluorescenza), e di mutazioni;
Lo studio delle interazioni proteina-acido nucleico, proteina-lipide, e proteina-proteina. In quest’ultimo caso, se si desidera valutare se due proteine siano o meno in grado di legarsi fra loro, è possibile associare a ciascuna delle due un fluoroforo: se le due proteine interagiscono, grazie alla stretta vicinanza fra di loro (e quindi fra i relativi fluorofori) si svilupperà FRET e il fluoroforo donatore sarà in grado di emettere una fluorescenza rilevabile (Figura 4b). In caso contrario, se le due proteine non si associano, la distanza tra i due fluorofori sarà troppo elevata perché avvenga FRET (Figura 4c);

Proteine A e B associate ai relativi fluorofori (a). Fluorescenza in presenza di legame (b). Nessuna fluorescenza in assenza di legame (c) — *Figura 4: Proteine A e B associate ai relativi fluorofori (a)*. *Fluorescenza in presenza di legame (b). Nessuna fluorescenza in assenza di legame (c)* [Oxford Instruments]

La quantificazione del DNA tramite la tecnica di Real-Time PCR. In questo caso si utilizzano due sonde oligonucleotidiche specifiche della sequenza di DNA di interesse e progettate per legarsi a sequenze adiacenti nel bersaglio, oltre a due primer di DNA specifici. Le sonde sono associate a due fluorofori in grado di generare FRET. Il fluoroforo donatore è attaccato all’estremità 3′ della prima sonda, mentre il fluoroforo accettore è attaccato all’estremità 5′ della seconda sonda. Durante la Real-time PCR le sonde si ibridano alle loro sequenze target in una disposizione testa-coda, avvicinando i fluorofori e consentendo il verificarsi di FRET. La quantità di fluorescenza dell’accettore è proporzionale alla quantità di DNA d’interesse presente, e permette quindi di quantificarlo (Figura 5).

*Figura 5: Principio di fluorescenza tramite Real-Time PCR* [Biorad.com]

Limitazioni del FRET

Le tecniche che si basano sul fenomeno FRET sono associate ad alcune limitazioni. Ad esempio, le proprietà di fluorescenza di molti fluorofori sono sensibili ai cambiamenti ambientali come variazioni di pH, concentrazioni ioniche, ossidazione, temperatura e indice di rifrazione. Inoltre, perché si verifichi FRET è necessario utilizzare due o più fluorofori, ciascuno dei quali può presentare sensibilità diverse per i cambiamenti nei fattori ambientali. Pertanto, le misurazioni FRET possono essere distorte da diversi parametri.

Probabilmente la più grande limitazione delle misurazioni FRET è il basso rapporto segnale-rumore (SNR) associato all’imaging FRET. Nonostante siano state sviluppate diverse tecnologie per misurare FRET, tutte soffrono di uno scarso SNR rispetto all’imaging che si ottiene misurando la fluorescenza di un solo fluoroforo.