Produzione di flavonoidi in saccharomyces cerevisiae

I flavonoidi sono delle molecole che appartengono a una classe di metaboliti secondari sintetizzati ubiquitariamente in tutto il regno vegetale, caratterizzati da una struttura polifenolica. Questa classe di molecole presentano molteplici attività biomediche come:

Antiossidanti
Antitumorali
Antimutagene
Antibatteriche
Antinfiammatorie

Figura 1 - Struttura generale dei flavonoidi — *Figura 1 – Struttura generale dei flavonoidi [https://www.tuscany-diet.net]*

Per tanto, queste molecole hanno attirato l’attenzione di molte industrie, in particolare farmaceutiche, nutraceutiche e alimentari per la produzione di farmaci ed integratori alimentari a base di flavonoidi.

I flavonoidi presentano una struttura chimica caratterizzata da 3 anelli dove quelli esterni sono anelli benzoici e contengono sei atomi di carbonio (Fig. 1; anello: A e B), mentre l’anello centrale è eterociclico composto da 3 atomi di carbonio (Fig. 1; anello: C). Queste molecole sono suddivise in sei categorie principali che si differenziano per diverse caratteristiche come ad esempio la saturazione di legame, l’idrossilazione e il posizionamento degli anelli aromatici:

Flavononi
Flavoni
Isoflavoni
Flavonoli
Catechine
Antociani

Queste molecole svolgono molteplici funzioni all’interno delle piante, tra cui:

Conferiscono colore alle piante;
Proteggono dai raggi UV ;
Partecipano nella sintesi simbiotica dell’azoto;
Agiscono come messaggeri o regolatori nel ciclo cellulare.

Dunque, per produrre in scala industriale queste molecole, bisogna prima identificare la loro biosintesi naturale che avviene nelle piante.

Biosintesi nelle piante

La via biosintetica dei flavonoidi nelle piante prende il nome di via del fenilpropanoide (Fig. 2), dove il metabolita primario è il glucosio, il quale, attraverso la glicolisi oppure attraverso la via dei pentosi fosfato, viene trasformato in Fosfoenolpiruvato (PEP) ed Eritrosio 4 fosfato (E4P). Questi due prodotti reagiscono per generare l’acido shikimico, il quale, una volta formato, entra nella via del Shikimato.

Inizio della reazione

Attraverso questa via l’acido shikimico viene trasformato in L-fenilanalina e L-tirosina, dopodiché i due amminoacidi entreranno nella via del fenilpropanoide. L-fenilelanina reagisce con l’enzima Fenilalanina Ammoniaca Liasi (PAL), che la converte in acido Cinnamico; quest’ultimo reagirà, successivamente, con l’enzima acido cinnamico 4 idrossilasi trasformandolo in Acido p-cumarico. La tirosina, invece, segue una via diretta e viene trasformata subito in Acido p-cumarico dall’azione dell’enzima Tirosina Ammoniaca Liasi (TAL).

Una volta creato l’acido p-cumarico, quest’ultimo reagisce con l’enzima 4-Cumarol-CoA Ligasi (4CL) e diventa in p-cumaroil-CoA, che in seguito reagirà con 3 molecole di Malonil-CoA attraverso l’enzima Calcone Sintasi (CHS). Tale passaggio porterà alla genesi del Calcolone, che è il precursore chiave per la produzione dei diversi sottogruppi dei flavonoidi.

Fine della reazione

Il Calcolone subisce prima una reazione di Isomerizzazione effettuata dall’enzima Calcone Isomerasi (CHI), che causa la chiusura dell’anello centrale, formando il Flavonoide. Infine, quest’ultima molecola subisce diverse reazioni enzimatiche come idrossilazione, trans-amminazione e ossido-riduzione, che porteranno alla produzione di diverse molecole appartenenti alla famiglia dei flavonoidi.

Figura 2 - Via del fenilpropanoide nelle piante — *Figura 2 – Via del fenilpropanoide nelle piante [https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.jafc.9b05218]*

Metodi di produzione

Le molteplici proprietà che possiedono queste molecole hanno portato nel corso del tempo a un aumento di interesse a livello aziendale per una produzione in larga scala, sviluppando diverse tecniche, come i metodi chimici, i metodi per estrazione e purificazione delle piante e il metodo bio-ingegneristico.

Metodi Chimici

Questi metodi consentono una produzione sintetica di flavonoidi, ottenendo una classe specifica pura. Tuttavia, queste molecole vengono sintetizzate mediante l’utilizzo di reazioni in condizioni estreme come alta temperatura, acidi e basi forti, metalli pesanti e sostanze chimiche tossiche. Pertanto questo tipo di tecnica non è stata considerata idonea per la fabbricazione industriale, dal momento che impatta gravemente l’ambiente, la produzione è minima, e inoltre, non sono stereoisomeri, quindi non biologicamente attive.

Metodi per estrazione e purificazione dalle piante

E’ la metodologia più utilizzata, poiché permette di ottenere una miscela di composti di flavonoidi biologicamente attivi, anche se la separazione nelle diverse classi di queste molecole necessita l’impiego di tecniche purificanti molto costose e che impattano notevolmente sull’ambiente. Tra l’altro, una delle sfide principali riguarda proprio le cellule vegetali che tendono a formare aggregati cellulari; questi possono influenzare l’attività enzimatica della coltura degli enzimi coinvolti nella via del fenilpropanoide a causa della formazione di zone d’ombra tra i diversi strati di cellule, dato che l’attività di questi enzimi è dipendente dalla luce. Di conseguenza, se l’attività enzimatica è compromessa, si otterrà una molecola flavonoide di bassa qualità con poca efficienza.

Metodo bio-ingegneristico

Questa nuova e innovativa tecnica consente di ottenere molecole biologicamente attive e pure (in termini di classe flavonoica) tramite l’utilizzo di microrganismi ospiti come Escherichia Coli, Saccharomyces cerevisiae e Yarrowia lipolytica. L’ingegnerizzazione di microrganismi ospiti viene adoperata per i seguenti motivi: hanno rapidi tassi di crescita, sono facili da coltivare, possono essere modificati geneticamente, sono tecniche economiche che non prevedono l’utilizzo di molta energia e reagenti chimici tossici.