Ogataea polymorpha, nuova fonte di acido ialuronico?

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E’ un lievito, non convenzionale, d’accordo, già per classificazione microbiologica, l’Ogataea polymorpha. Chi ne ha sentito parlare, prima d’ora? Eppure è una fucina inestinguibile di vaccini, enzimi, prodotti biofarmaceutici, da circa trent’anni. Oggi, però, potrebbe rivelarsi fondamentale anche per la sintesi indotta di acido ialuronico. Ed il glicosaminoglicano delle meraviglie, non ha certo bisogno di presentazioni.

Ogataea polymorpha e la chimica dei lieviti

Negli anni, il ricorso a microrganismi unicellulari, come fabbriche citologiche di proteine ricombinanti, si è fatto prassi sperimentale, su scala mondiale. A guidare audaci ipotesi biochimiche verso la realizzazione concreta, le tecniche di ricombinazione genetica del DNA. Esse, infatti, consentono articolati disegni di rimodulazione dei codici genetici microbici, mediante l’introduzione di geni estranei, in un determinato organismo ospite, per indurlo a produrre per noi un certo prodotto; proteine eterologhe, biologicamente attive, per esempio.

Comprensibilmente, in un contesto del genere, la scelta dell’ospite microbico è quanto mai cruciale: funzionalità, solubilità ed attività della proteina, dovranno, infatti, essere ben preservate, durante tutto il processo di biosintesi.

I lieviti sono comunemente utilizzati per tali fini, specialmente quelli che richiedono modifiche post-traduzionali, per un corretto ripiegamento delle proteine, poiché queste modifiche si verificano meno frequentemente nei procarioti. Una modificazione post-traduzionale è, di fatto, la modificazione chimica di una proteina in seguito alla sua traduzione. Per molte proteine, si tratta dell’ultima tappa della loro biosintesi. Alcune, sia eucariotiche che procariotiche, raggiungono la loro conformazione biologicamente attiva solo dopo aver subìto una o più modificazioni.

Cos’è poi un lievito?

Lieviti, dal latino levĭtum, der. di levare «alzare», sono un particolare gruppo di funghi unicellulari, caratterizzati dalla capacità di replicarsi per gemmazione (perciò «blastomiceti») e metabolizzare preferibilmente zuccheri (quindi «saccaromiceti»), mediante ossidazioni o riduzioni (fermentazione). Sono dunque, ognuno, una singola cellula eucariotica, vale a dire dotata di nucleo; di un solo nucleo, in genere. Di forma ellittica, ma anche sferica, la cellula contiene un citoplasma dotato di vacuoli e gocce lipidiche. Essa è poi rivestita di membrana plasmatica, composta, come sempre, da lipidi, proteine e polisaccaridi.

Identità non convenzionale: Ogataea polymorpha

Il lievito Ogataea polymorpha (figura 1) è impiegato comunemente come piattaforma di espressione, per le sue uniche caratteristiche. E’ termo-tollerante e capace di crescere a temperature che vanno da 30°C a 50°C. Questa peculiarità è molto vantaggiosa, nella sintesi di proteine dei mammiferi, come di quelle che necessitano di 37°C per mantenere la propria attività biologica. Inoltre, la presenza in esso di una via di glicosilazione delle proteine, consente la produzione di autentiche proteine eucariotiche ricombinanti; in più, Ogataea polymorpha aggiunge meno residui glucidici al core proteico, evitando l’iperglicosilazione delle proteine.

Ogataea polymorpha è capace di utilizzare il metanolo come fonte di carbonio (figura 2), e così consente anche di isolare promotori metanolo-inducibili forti. Tuttavia, può altresì servirsi di altre fonti carboniose: glucosio, glicerolo, xilosio e cellobiosio.

Il glicosaminoglicano delle meraviglie: l’acido ialuronico

Attraverso l’ingegnerizzazione metabolica e gli approcci di sintesi biologica, oggi, si possono costruire ceppi microbici ricombinanti, per produrre composti chimico-farmaceutici, bypassando le sintesi chimiche. Uno di questi composti, dal multiforme valore aggiunto, è l’acido ialuronico. Biopolimero con caratteristiche di alta viscosità ed elasticità, che abbonda nella matrice extra-cellulare del connettivo dei vertebrati. Per la sua biocompatibilità, l’acido ialuronico trova diverse applicazioni nei settori: medicale, cosmetico e parafarmaceutico.

Tanto che, secondo la Grand View Research Inc., il mercato globale di acido ialuronico (HA) potrà facilmente raggiungere i 16.6 miliardi di dollari, nel 2027.

E dunque, è un glicosaminoglicano, composto da unità disaccaridiche ripetute, di acido glucuronico (UDP-GlcUA) ed UDP-N-acetilglucosamina (UDP-GlcNAC) uniti da legami glicosidici β-1,4 e β-1,3. La sua sintesi è catalizzata dalla ialuronano sintasi (HAS), codificata dal gene hasA, e responsabile tanto dell’assemblaggio dei precursori nel citosol, quanto dell’elongazione della catena polimerica e del suo rilascio nella matrice extra-cellulare.

Batteri Gram-positivi e lieviti sono, in quest’ambito, i microrganismi più utilizzati per produrre HA eterologo, specialmente quelli contrassegnati dallo stato GRAS (generally recognized as safe). I ricercatori ricorrono spesso ai generi Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, and Lactococcus lactis, per ottenere il polimero. I batteri, infatti, possiedono la via completa di sintesi di entrambi i precursori, mentre i lieviti, dal canto loro, sono solo naturalmente capaci di sintetizzare UDP-GlcNAC.

La lunga strada verso la manipolazione genetica di Ogataea polymorpha

Nei lieviti, quindi, in aggiunta al gene hasA, la produzione di HA ha assoluto bisogno del gene hasB, che codifica per l’enzima UDP-glucosio-6-deidrogenasi, padre del precursore ialuronico UDP-GlcUA.

Fino adesso, solo due lieviti hanno subìto manipolazione, per fornire acido ialuronico: Kluyveromyces lactis e Komagataella phaffii (precedentemente detto Pichia pastoris). In termini di strumenti genetici disponibili, per Ogataea polymorpha, sono noti promotori endogeni, con vari meccanismi di regolazione, che favoriscono il fiorire di varie strategie di gestione dell’espressione genica.

Essendo un lievito metilotrofico, molti dei promotori idonei sono correlati al metabolismo del metanolo. Essi, dunque, regolano l’espressione dei geni codificanti per enzimi della via metabolica del metanolo. Nel caso specifico, in più, sono noti anche promotori correlati al metabolismo dei nitrati, inducibili da fonti d’azoto (YNR1 e YNI1). Altri ancora, sono correlati ad incrementi di temperatura (TPS1 e HSA1).

Pur tutti disponibili, per Ogataea polymorpha, si prediligono promotori metanolo-inducibili, nel controllo dell’espressione di geni eterologhi. E le startegie di coltura, in questo caso, si articolano su due fasi:

  • fase di crescita, con focus sulla produzione di biomassa (utilizzando glucosio o glicerolo),
  • seguita da fase di induzione metabolica, per produrre la proteina eterologa.

Perciò, l’impiego di promotori metanolo-inducibili, consente di ordire strategie di disaccoppiamento della crescita del lievito, dalla sintesi del suo prodotto. Alcuni metodi disaccoppianti sono particolarmente proficui nella sintesi di composti, la cui via metabolica competa con quella di produzione della biomassa. Proprio come avviene per la produzione di acido ialuronico.

Lo studio: dallo stato dell’arte, alla nuova prassi

Il promotore più efficace, in Ogataea polymorpha, deve controllare il gene per l’enzima metanolo ossidasi (pMOX e pAOX). Nonostante esso sia principalmente regolato dal metanolo e soppresso dal glucosio, risulta, tuttavia, attivo in condizioni limitanti di glucosio, portando comunque a perdita del promotore. Questo, naturalmente, può inficiare le procedure di regolazione genica. C’è da aggiungere, inoltre, che il promotore pMOX risulta depresso da fonti di carbonio alternative al metanolo, quali glicerolo, xilosio, ribosio, sorbitolo.

L’impiego, dunque, di tali promotori è scoraggiata dalla loro perdita, sotto alcune fonti di carbonio, ma anche dalla tossicità del metanolo, e dalla sua infiammabilità, specie su scala industriale. Per questo sono, nel tempo, subentrate ipotesi comprensive di altri promotori, dalle rese, bisogna dirlo, del tutto insoddisfacenti però.

Deus ex machina, in questo groviglio di intenti e strumenti, lo switch genetico. Esempio perfetto, la serina integrasi, che consente la costruzione di veri e propri circuiti, attraverso il riarrangiamento della molecola di DNA target. Se, infatti, vengono inseriti due siti di riconoscimento (attB e attP), al fianco della voluta sequenza di DNA, l’integrasi è capace di individuare tali siti e capovolgere la sequenza di 180°. Ciò consente, quindi, un’adeguata regolazione genica, una volta che ogni elemento genetico (promotore, sequenza codificante e/o terminatore) sia costruito al fianco di tali siti «att». La rotazione della sequenza del DNA può verificarsi, però, in condizioni specifiche.

Prologo di un lavoro senza precedenti

I ricercatori, dunque, guidati da João Heitor Colombelli Manfrão-Netto, hanno operato necessarie modificazioni geniche, pur di conseguire la produzione eterologa di acido ialuronico (HA), da Ogataea polymorpha. Qui, le manipolazioni geniche sono rappresentate dalla integrazione dei geni hasA e hasB, nel genoma dell’ospite fungino. Con varie regolazioni da promotori. Testate, infatti, le diverse combinazioni, allo scopo di valutarne l’incidenza sul titolo di HA ottenibile.

Essi, si sono serviti, in realtà, di due geni hasA: hasAs, da Streptococcus zooepidemicus, e hasAp, da Pasteurella multocida. Quest’ultimo, rientra nei saggi poichè hasB, da Xenopus laevis, codifica per un enzima rivelatosi più attivo in un altro ceppo fungino, non convenzionale, Kluyveromyces lactis.

Cronache di laboratorio

Il ceppo di Ogataea polymorpha coinvolto nelle prove è NCYC495yku80, e rappresenta il wild type (WT). Per il clonaggio a mezzo plasmidi ed espansione successiva, c’è l’E. coli DH10B. Tutti i plasmidi sono, poi, confermati dall’analisi con enzimi di restrizione e PCR.

In totale, i ricercatori hanno costruito 4 ceppi di Ogataea polymorpha NCYC495yku80: EMB 101, EMB 102, EMB 103, EMB 104. La stabilità dell’integrazione condotta, viene confermata con accuratezza durante tutto lo studio: ci pensano le numerose PCR sulle colonie, derivanti da passaggi sequenziali e consecutivi sulle piastre con terreni selettivi.

I protagonisti microbici

E. coli viene ottenuto da coltura in LB, a 37°C e 200 rpm. Per la selezione di cellule ospitanti i plasmidi, il mezzo di crescita ha subìto supplementazione di ampicillina (100 mg/mL).

Ogataea polymorpha, invece, proviene da coltura e mantenimento in YPD (1% estratto di lievito, 2% peptone, 2% glucosio), a 37°C e 200 rpm.

I ceppi trasformati, infine, sono selezionati e mantenuti in terreni supplementati con 100 µg/mL di zeocin o 300 µg/mL di igromicina, a seconda della resistenza dei markers.

Nelle pieghe del metodo di crescita

Cellule provenienti da ogni ceppo costruito, ed il WT, sono state cresciute preventivamente overnight in YPD, supplementato con opportuni antibiotici laddove necessari. Tali colture, poi, trasferite in flaconi da 1L, sotto agitazione, contenenti YPD ed incubati per 24 ore. Si aspira, infatti, ad un’elevata densità cellulare.

A questo punto, i ricercatori aggiungono metanolo 1%, alla settima e ventunesima ora, per operare induzione dei geni has. Dopo 24 ore, le cellule sono raccolte e lavate con soluzione salina di NaCl 9 g/L. Trasferite, quindi, in nuovo flacone da 1L, contente un medium ottimizzato per la produzione di acido ialuronico: 4% glucosio, 0.75% estratto di lievito, 1% peptone, 0.25% K2HPO4, 0.05% MgSO4, 0.5% NaCl, 0.04% glutammina, 0.06% acido glutammico e 0.02% acido ossalico.

Il glucosio viene aggiunto al 2%, in corso di coltura, per evitarne condizioni limitanti, ed a 48 ore la coltura può dirsi conclusa. Si procede con la quantificazione dell’acido ialuronico.

L’estrazione dell’acido ialuronico

Il processo di estrazione si consegue mediante l’aggiunta, di egual volume (0.1% w/v), di una soluzione di SDS. I campioni sono tenuti sotto agitazione orbitale, per 10 minuti. Quindi centrifugazione per 5 minuti a 4500xg. Poi 1.5 volumi di etanolo, aggiunti al sovranatante, che viene così incubato a 4°C overnight, per 10 ore. Successivamente, i ricercatori centrifugano i campioni a 4500xg, a 4 °C, per 30 minuti. Il pellet, lavato con 25 mL di soluzione di etanolo 75% e cloruro di sodio 25%. Quindi ancora centrifugato.

Il sovranatante è scartato ed il pellet incubato a temperatura ambiente, quindi risospeso in acqua MilliQ, dopo la dovuta evaporazione dell’etanolo. In tutto ciò, il WT fa da controllo negativo.

Osservazioni SEM e quantificazioni

Come restituito dal SEM, in colture da 24 ore, le cellule WT paiono chiaramente discrete, con pareti cellulari separate ed una moderata aggregazione. Quelle dei ceppi EMB 102 e 104 non mostrano differenze apprezzabili in superficie. Il ceppo EMB 103, invece, si distingue dagli altri.

Innanzitutto, possiede pareti cellulari discrete e tra le cellule non sono evidenti le modificazioni degli altri ceppi. Una sorta di intensificazione di aggregazione, si apprezza, e singole cellule libere meno frequenti. In definitiva, le cellule EMB 103 sembrano ricoperte da una sostanza che le incolla le une alle altre, generando una superficie cellulare irregolare. Questo, indica produzione di acido ialuronico.

Il ceppo EMB 103 è costruito con uno switch genico per l’espressione di hasA e hasB. I ricercatori, infatti, hanno adoperato una serina integrasi, per guidare la loro espressione genica. L’integrasi selezionata è la Integrasi-13 (Int13), per la sua versatilità: è impiegata tanto nell’uomo, quanto in mammiferi ed in specie vegetali. Essa permette la funzionalità di entrambi i geni. E, davvero, lo switch genico in Ogataea polymorpha funziona.

Non solo. Ma i ricercatori hanno riscontrato che la integrasi-13 non rivela mutazioni puntiformi o impatti nocivi sulla vitalità cellulare. Tutto ciò, non ha precedenti.

L’acido ialuronico di Ogataea polymorpha: presto, molto presto

La produzione, nelle condizioni applicate, è limitata. Certo. Allora, il sistema sperimentale può dirsi sub-ottimale. Però, la produzione di acido ialuronico da Ogataea polymorpha si attesta, pur sempre, su 197.76 µg/mL. Dimostrazione esigua, non si discute, tuttavia incontrovertibile, del brillante potenziale del lievito non convenzionale.

E l’ottimizzazione è alle porte.

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