Microscopia crioelettronica a trasmissione

Un potente strumento per l’analisi di sistemi biologici complessi

La microscopia crioelettronica (abbreviato: cryo-EM) è una tecnologia rivoluzionaria che ha guadagnato terreno nella comunità scientifica negli ultimi anni. La microscopia crioelettronica é un potente strumento per visualizzare la struttura di sistemi biologici complessi, come proteine ​​e virus, a livello atomico. La cryo-EM permette ai ricercatori di ottenere informazioni importanti sui meccanismi molecolari responsabili di molti processi biologici, con l’obiettivo di sviluppare nuovi trattamenti e terapie.

Questo articolo discuterà della svolta della cryo-EM e di come sta rivoluzionando la ricerca in vari campi oltre a quali potenziali applicazioni potrebbe avere in futuro.

Detta anche microscopia elettronica criogenica, questa tecnica ha rivoluzionato il campo della ricerca biologica fornendo ai ricercatori informazioni senza precedenti sulla struttura e sulla funzione delle proteine cellulari, in quanto è una potente tecnica di imaging che consente ai ricercatori di osservare proteine ​​e altre molecole a livello atomico.

La microscopia crioelettronica é utilizzata principalmente per studiare singole particelle, come virus, batteri e proteine, nel loro ambiente naturale. Attraverso questa tecnica, i ricercatori possono analizzarne in dettaglio la struttura e ottenere informazioni su come interagiscono tra loro e con il loro ambiente, oltre a caratterizzare al meglio, ad esempio, la funzione di alcune proteine (solitamente legata alla loro struttura), od ottenere informazioni accurate e dettagliate sulla struttura dei virus e dei loro siti di legame con le cellule.

Virus Zika microscopia crioelettronica
Figura 1 – Immagine 3D del virus Zika e del target del legame antigene – anticorpo, ottenute tramite microscopia crioelettronica. [Fonte: Sirohi et al.]

Con le informazioni acquisite tramite l’uso della microscopia crioelettronica, gli scienziati possono potenzialmente sviluppare nuove strategie terapeutiche per malattie come il cancro o il morbo di Alzheimer.

Il laboratorio di microscopia crioelettronica: la preparazione del campione

Nel laboratorio di microscopia crioelettronica, come precedentemente anticipato, si analizzano complessi macromolecolari. Le analisi partono dalla preparazione e purificazione del campione, alla base di ogni tecnica di biologia strutturale, seguite poi da una serie di step al cui termine il campione viene fatto aderire ad un apposito supporto o griglia. Per garantire la qualità dei risultati, tutte le operazioni vengono svolte in un ambiente dedicato.

Passaggi per una preparazione adeguata

Nel primo step, variabile in base al tipo di campione, si procede alla produzione di copie in modo da ottenere una quantità sufficiente per l’analisi. Nel caso dell’analisi di singole proteine si devono considerare fattori quali la solubilità e la funzionalità della proteina in analisi, oltre alla velocità e la resa della successiva purificazione .

Il secondo step è la purificazione del campione, tramite l’uso di cromatografia per affinità, che permette la purificazione di proteine ed anticorpi, oltre all’uso di proteasi per rimuovere eventuali altre proteine non target dell’analisi.

Step per la preparazione del campione per microscopia crioelettronica
Figura 2 – Sequenza di step per la preparazione del campione per microscopia crioelettronica. [Fonte: Thermofisher scientific]

Il terzo step valuta la qualità del campione ottenuto, necessaria per determinare se il campione, una volta purificato, é adatto all’analisi al microscopio crioelettronico. Il campione ottenuto potrebbe infatti contenere sottocomplessi di composizione diversa o composti con conformazioni strutturali differenti da quelle della singola proteina da analizzare.

Si utilizza a tale scopo la microscopia elettronica a colorazione negativa, per determinare qualitativamente la composizione delle particelle e l’omogeneità conformazionale. In alternativa, la spettrometria di massa nativa può essere utilizzata per esaminare rapidamente il campione per la stabilità biochimica, l’aggregazione delle proteine e l’eterogeneità conformazionale.

La vitrificazione: sospendere le particelle in un sottile strato di ghiaccio, alterandole minimamente

Per bloccare le singole particelle nel loro stato nativo, la soluzione contenente il materiale del campione deve essere congelata. Questo processo é chiamato vitrificazione.

Nel quarto step, le proteine purificate sono sospese in ghiaccio amorfo attraverso un rapido congelamento a immersione, che preserva le strutture native dei campioni. Il congelamento deve avvenire abbastanza rapidamente per evitare di alterare eccessivamente campione e la formazione di ghiaccio cristallino.

In questo passaggio é necessario mantenere il campione a temperature di azoto liquido per preservare il sottile strato di ghiaccio incorporato ed evitare danni alle particelle biologiche. Le proteine purificate sono sospese in ghiaccio amorfo tramite un rapido congelamento ad immersione, per preservarne quanto più possibile la struttura nativa. La vetrificazione permette un’incorporazione e distribuzione uniforme delle singole proteine in un sottile strato di ghiaccio amorfo (vetroso).

L’importanza della qualità nella preparazione del campione

La qualità del campione non solo può contribuire a una risoluzione più elevata, ma può anche influenzare il processo di vetrificazione stesso. L’ottimizzazione delle condizioni del tampone e/o degli additivi può prevenire l’aggregazione, la dissociazione e persino l’orientamento preferito delle particelle sulla griglia durante la vitrificazione.

Una volta vetrificato, il campione deve essere valutato con la cryo-EM diagnostica prima di iniziare l’acquisizione dei dati ad alta risoluzione. L’obiettivo dell’ultimo step (“grid screening“) è valutare qualitativamente se il campione è promettente per l’analisi e, contemporaneamente, ottenere una mappa iniziale a bassa risoluzione. Durante questa fase il campione é sottoposto a un pre-screening per valutare concentrazione, stabilità e distribuzione delle proteine oltre a qualità, spessore e uniformità del ghiaccio sulla griglia.

Se il campione è promettente, si può acquisire una serie più ampia di immagini per facilitare ulteriori analisi 2D e 3D. In questa fase è necessaria solo una mappa 3D a risoluzione moderata (> 3Å). A questo scopo si utilizzano criomicroscopi elettronici a trasmissione con capacità di risoluzione più basse, ma che consentano poi il trasferimento del campione al criomicroscopio che verrà utilizzato per l’analisi finale, a maggiore risoluzione (<3 Å).

Visualizzazione della griglia
Figura 3 – Visualizzazione della griglia. Nella preparazione del campione per microscopia crioelettronica é necessario verificare l’omogeneità della particella coinvolta. [fonte: TFS asset workflow].

Cryo-TEM ad alta risoluzione

Una volta terminata la preparazione e la verifica della qualità del campione, questo viene trasferito tramite un braccio robotizzato in grado di tollerare le basse temperature coinvolte, al cryo-TEM ad alta risoluzione. Successivamente si procederà all’analisi dei dati, ovvero l’acquisizione delle immagini.

Oltre all’analisi di singole particelle (SPA), il cryo-TEM può essere utile per altre applicazioni automatizzate come la tomografia crioelettronica (cryo-ET) e la diffrazione di microelettroni (microED).

I microscopi crioelettronici a trasmissione di ultima generazione sono piuttosto compatti. Sono formati da una pistola a emissione di campo freddo che consente di ottenere immagini con un contrasto più elevato e una risoluzione atomica. Questo componente consente infatti di risolvere in modo efficiente strutture con risoluzioni di 2,0 Å o inferiori.

microscopio elettronico criogenico Krios G
Figura 4 – Krios G4 Cryo-TEM. [Fonte: Thermofisher Scientific].

Oltre all’emissore di elettroni in campo freddo, il cryo-TEM comprende un rilevatore di elettroni ed un filtro per l’acquisizione delle immagini.

Componenti  di un microscopio crioelettronico
Figura 5 – Componenti di un microscopio crioelettronico. [Fonte: brochure dello strumento].

Per quanto riguarda lo strumento illustrato in questo articolo, il Krios G4, é dotato di un autoloader grazie al quale i campioni possono essere prelevati e trasferiti senza contaminazione a un altro apparecchio.

La connettività integrata garantisce un percorso stabile e privo di rischi per l’intero flusso di lavoro, dalla preparazione e ottimizzazione dei campioni all’acquisizione delle immagini e all’elaborazione dei dati.

Software per la visualizzazione dei risultati

É possibile raccogliere ed archiviare i dati delle immagini ottenute ed i metadati associati acquisiti da qualsiasi sistema di imaging, derivanti dal software di elaborazione o da qualsiasi altro dato tramite appositi software. Si possono importare le immagini ottenute automaticamente o tramite caricamento manuale.

Faremo riferimento a due software proposti dalla Thermofisher Scientific Amira ed Athena.

Il primo consente di visualizzare, elaborare e analizzare dati biologici complessi in 3D, con un’interfaccia semplice e personalizzabile.

Il software Athena offre funzionalità avanzate per la visualizzazione di immagini, dati e metadati in remoto e in tempo reale. I principali formati 2D e 3D possono essere visualizzati automaticamente in visualizzatori dedicati ad alte prestazioni direttamente dall’interfaccia web di Athena Software, anche utilizzando dispositivi standard.

È inoltre possibile visualizzare tramite file PDF, facilitando la lettura delle informazioni e dei report necessari per i progetti di ricerca, mentre l’aggiunta, la modifica e la visualizzazione dei metadati sono facilitate dall’interfaccia altamente intuitiva del portale web del software.

La rapida ascesa della cryo-EM: visualizzazione delle singole proteine e dell’RNA per approfondire il rapporto struttura/funzione

Il numero di strutture riportate a risoluzioni quasi atomiche (risoluzioni migliori di 4 Å) nella EM Data Bank è passato da 36 nel 2014 a 114 e 240 rispettivamente nel 2015 e nel 2016.

Riportiamo due esempi: il primo, l’analisi di una singola proteina, la TRPM4, il secondo invece fa riferimento ad una metodica ibrida che permette la visualizzazione della struttura dell’RNA.

Il canale del potenziale cationico del recettore transiente, membro della sottofamiglia M (hTRPM4), noto anche come melastatina-4, è una proteina che nell’uomo è codificata dal gene TRPM4. Nel dicembre 2017 sono state pubblicate nella stessa settimana tre strutture di TRPM4, tra cui TRPM4 umana con e senza legame al Ca2+, TRPM4 di topo con e senza legame all’ATP, TRPM4 umana con legame al decavanadato e una struttura di TRPM8. Un’altra struttura dell’apo TRPM4 umano è stata pubblicata due mesi dopo. Le informazioni sulla struttura di tutti questi lavori sono complementari tra loro e forniscono una quantità sostanziale di informazioni strutturali su questa sottofamiglia di canali TRP.

Strutture di TRPM4
Figura 6 – Strutture di TRPM4 ottenute tramite microscopia crioelettronica. [Fonte: Cheng Y.]

La single particle analysis crio-EM ha permesso inoltre di determinare 11 strutture di RNA precedentemente sconosciute con una risoluzione compresa tra 4,7 e 10 Å, che ha rivelato caratteristiche esplicite dell’RNA di scanalature maggiori e minori.

Ribosolve é un metodo ibrido che integra mappe crio-EM a moderata risoluzione, mappatura chimica e modellazione computazionale Rosetta, ha dimostrato la sua applicazione a tredici strutture di soli RNA prive di proteine, da 119 a 338 nucleotidi, precedentemente sconosciute.

Step per la visualizzazione dell'RNA
Figura 7 – Step per la visualizzazione dell’RNA in cryo-EM. [Fonte: Ma H et al.]

Conclusioni sulla microscopia crioelettronica

L’applicazione della microscopia elettronica per la determinazione della struttura delle proteine, come quella della crio-EM a singola particella, si è ormai affermata come un metodo all’avanguardia per lo studio di complessi proteici che coprono un’ampia gamma di dimensioni.

É sempre più evidente che, oltre alla disponibilità di migliori rivelatori e di migliori strumenti di elaborazione delle immagini, saranno necessari approcci personalizzati per la stabilizzazione delle proteine e la preparazione dei campioni per far progredire ulteriormente la portata della crio-EM nei prossimi anni.

Fonti

  • https://bioscienzebio.unimi.it/facility_crio
  • https://www.thermofisher.com/
  • Earl LA, Falconieri V, Milne JL, Subramaniam S. Cryo-EM: beyond the microscope. Curr Opin Struct Biol. 2017 Oct;46:71-78. doi: 10.1016/j.sbi.2017.06.002. Epub 2017 Jun 21. PMID: 28646653; PMCID: PMC5683925.
  • Cheng Y. Membrane protein structural biology in the era of single particle cryo-EM. Curr Opin Struct Biol. 2018 Oct;52:58-63. doi: 10.1016/j.sbi.2018.08.008. Epub 2018 Sep 13. PMID: 30219656; PMCID: PMC6296881.
  • Ma H, Jia X, Zhang K, Su Z. Cryo-EM advances in RNA structure determination. Signal Transduct Target Ther. 2022 Feb 23;7(1):58. doi: 10.1038/s41392-022-00916-0. PMID: 35197441; PMCID: PMC8864457.
  • Kappel, K., Zhang, K., Su, Z. et al. Accelerated cryo-EM-guided determination of three-dimensional RNA-only structures. Nat Methods 17, 699–707 (2020). https://doi.org/10.1038/s41592-020-0878-9
  • https://www.boincitaly.org/articoli/news/23-rosetta-home.html

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