Trichostrongylus colubriformis

Caratteristiche

Il Trichostrongylus colubriformis è un verme parassita appartenente al phylum dei nematodi, ossia i vermi cilindrici, in contrapposizione ai vermi piatti (platelminti). I vermi del genere Trichostrongylus albergano soprattutto nell’intestino degli erbivori, tra cui pecore, bovini, conigli, cervi, asini, capre e uccelli, con una distribuzione globale. Almeno dieci specie, tra cui il T. colubriformis, il T. orientalis e il T. axei, sono state collegate a infezioni umane accidentali (zoonosi), che si verificano generalmente nelle regioni temperate e nelle aree rurali con scarse condizioni sanitarie in seguito allo stretto contatto con animali da fattoria, tramite ingestione di larve infettanti presenti nei vegetali e nell’acqua, contaminati dalle feci dell’ospite. In ogni caso, le infezioni umane sono maggiormente prevalenti in Asia e nel Medio Oriente.

Come tutti i nematodi, il T. colubriformis è caratterizzato da un corpo cilindrico, non segmentato e a simmetria bilaterale, affusolato alle due estremità (Fig. 1); la parete è un sacco muscolo-tegumentale che permette, oltre al movimento, il trasporto di acqua e sostanze organiche. È rivestito da uno strato esterno, la cuticola, che, non essendo estensibile, viene cambiato quattro volte durante lo sviluppo (quattro mute).

Verme adulto di Trichostrongylus spp. [http://vetbook.org/wiki/rabbit/index.php/Trichostrongylus_spp]
Figura 1 – Verme adulto di Trichostrongylus spp. [http://vetbook.org/wiki/rabbit/index.php/Trichostrongylus_spp]

Inoltre, non possiede i sistemi circolatorio e respiratorio, il sistema nervoso è alquanto rudimentale; nello pseudocele, ovvero la cavità generale del corpo, sono racchiusi gli apparati digerente, escretore e riproduttore. A proposito di quest’ultimo, il maschio è dotato di strutture di accoppiamento simili a lancette, le spicole copulatorie, che servono per facilitare l’apertura della vulva durante l’accoppiamento e iniettare lo sperma (Fig. 2B). Come gran parte dei nematodi intestinali, il T. colubriformis è oviparo, cioè la femmina rilascia le uova (Fig. 2A), da cui si liberano le larve.

Vermi adulti di T. colubriformis provenienti da campioni umani nel Laos. A) Femmina adulta in cui si notato le uova uterine in fila. B) Spicole copulatorie del maschio adulto [Tai-Soon Yong et al., 2007]
Figura 2 – Vermi adulti di T. colubriformis provenienti da campioni umani nel Laos. A) Femmina adulta in cui si notato le uova uterine in fila. B) Spicole copulatorie del maschio adulto [Tai-Soon Yong et al., 2007]

Filogenesi

Dominio              Eukarya

Regno                  Animalia

Phylum                Nematoda

Classe                  Secementea

Ordine                 Strongylida

Famiglia               Trichostrongylidae

Genere                 Trichostrongylus

Specie                  T. colubriformis

Ciclo vitale e patogenesi

Raffigurazione schematica del ciclo vitale di T. colubriformis
Figura 3 – Raffigurazione schematica del ciclo vitale di T. colubriformis – https://www.cdc.gov/dpdx/trichostrongylosis/index.html

Ugualmente agli altri nematodi intestinali, il T. colubriformis è distinto da un ciclo vitale diretto (Fig. 3), ossia non necessita di ospiti intermedi e si compie in un unico organismo ospite. Le uova (Fig. 4A) vengono emesse tramite le feci dagli animali infetti, e in condizioni favorevoli, con temperatura di 20-26 °C e umidità, si schiudono e rilasciano le larve. Queste passano attraverso quattro stadi prima di diventare adulti: nei primi due (L1 e L2) vivono nel suolo o sulla vegetazione, e hanno un esofago rabditoide, cioè che possiede un bulbo con valvole tricuspidi, mediante il quale le larve possono ingoiare particelle solide (Fig. 5). Nel terzo stadio (L3) (Fig. 4B), invece, l’esofago è di tipo capillare (strongiloide) (Fig. 5), e consente alle larve di nutrirsi esclusivamente delle sostanze liquide dell’organismo ospite, obbligandole quindi alla vita parassitaria. Allo stadio L3 le larve divengono infettanti; una volta ingerite, arrivano all’intestino tenue, che raffigura la zona in cui raggiungono il quarto stadio (L4) per poi trasformarsi in vermi adulti.  

Uovo (A) e larva al terzo stadio (B) di T. colubriformis isolati dalle feci di una donna di 47 anni [“Trichostrongylus colubriformis Nematode Infections in Humans, France”, Emerging Infectious Diseases, 2011]
Figura 4 – Uovo (A) e larva al terzo stadio (B) di T. colubriformis isolati dalle feci di una donna di 47 anni [“Trichostrongylus colubriformis Nematode Infections in Humans, France”, Emerging Infectious Diseases, 2011]
Raffigurazione sintetica della larva rabditoide (1) e della larva strongiloide (2). ER: esofago di tipo rabditoide, ES: esofago di tipo strongiloide, MG: macula germinativa [Cancrini G., 2013]
Figura 5 – Raffigurazione sintetica della larva rabditoide (1) e della larva strongiloide (2). ER: esofago di tipo rabditoide, ES: esofago di tipo strongiloide, MG: macula germinativa [Cancrini G., 2013]

Di solito la tricostrongilosi umana è asintomatica o associata a sintomi lievi. Gli individui che sviluppano la malattia sintomatica possono accusare dolore addominale, nausea, diarrea, flatulenza, vertigini, fatica e malessere. Si osserva abitualmente l’eosinofilia. Le infezioni caratterizzate da un’elevata carica parassitaria possono provocare anemia, colecistite e deperimento.

A proposito dell’infezione umana da T. colubriformis, è utile esporre alcuni casi avvenuti in diverse parti del mondo. Il primo, che risale all’aprile del 2009, riguarda una donna francese di Saint-Jeannet, la quale mostrava sintomi come dolore allo stomaco, gonfiore addominale e diarrea occasionale. Le analisi ematologiche evidenziarono un incremento della conta degli eosinofili, e tra il 9 giugno e il 2 luglio furono eseguiti gli esami parassitologici per la ricerca di elminti su sei campioni fecali utilizzando vari metodi (indagine microscopica diretta, concentrazione con formalina ed etilacetato, estrazione delle larve con tecnica di Bearmann, concentrazione con soluzione di mertiolato, iodio e formalina). L’indagine microscopica diretta e con metodo di Bearmann diedero un risultato negativo, mentre tramite la concentrazione con formalina ed etilacetato vennero individuate un uovo e una larva al terzo stadio (Fig. 4), che appartenevano al genere Trichostrongylus. Tuttavia, date le ambigue caratteristiche morfologiche, fu necessario un approccio molecolare al fine di identificare la specie. A partire da due larve al terzo stadio il personale di laboratorio effettuò l’estrazione del DNA mediante il kit DNA Tissue Mini (QIAGEN, Hilden, Germany), seguito dall’amplificazione tramite PCR della sequenza di DNA spaziatore interna di tipo 2 (internal transcribed sequence 2, ITS2) e dal sequenziamento di questa. Infine, attraverso l’analisi bioinformatica, si ottenne un’omologia del 100% con le sequenze conosciute di adulti di T. colubriformis provenienti dalle pecore.

Il secondo caso, pubblicato nel 2011 sulla rivista American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, avvenne in un villaggio rurale del Laos (Lahanam Village), dove quasi il 50% degli abitanti risultarono positivi alla presenza di uova di vermi nematodi in seguito all’analisi delle feci. Le uova apparivano eterogenee dal punto di vista morfologico e delle dimensioni, suggerendo infezioni da parte di nematodi di specie differenti. Allo scopo di identificare le specie, 46 individui, su base volontaria, furono trattati con albendazolo e, dopo la terapia, i vermi adulti furono raccolti dai campioni fecali purificati; un partecipante era positivo alle uova di Necator Americanus e altri due alle uova di Ancylostoma duodenale. Invece, in 43 partecipanti vennero individuate uova di Trichostrongylus, la cui specie fu confermata grazie alla valutazione morfologica e all’esame delle sequenze ITS2 mediante PCR, sequenziamento e analisi bioinformatiche con BioEdit; la specie era T. colubriformis. In aggiunta a ciò, alcuni vermi di Trichostrongylus furono isolati anche dalle capre nello stesso villaggio e accertati come T. colubriformis. Tali risultati evidenziarono che il T. colubriformis rappresentava la maggiore specie zoonotica responsabile di infezioni da nematodi intestinali.

Per concludere, nel 2014, nella provincia di Gilan, in Iran, si verificarono quattro casi di tricostrongilosi che furono erroneamente diagnosticati come infezione acuta da Fasciola spp. Tre sorelle di 33, 35 e 38 anni, e il fratello di 41 manifestavano i seguenti sintomi:

  • Sorella 1: leggero dolore addominale ed epigastrico che si irradiava alla schiena, arrossamento, rigidità, diarrea severa, perdita di appetito e orticaria;
  • Sorella 2: dolore epigastrico ed epatico, debolezza, nausea, flatulenza, diarrea continua e lesioni orticarioidi;
  • Sorella 3: dolore addominale ed epigastrico, riduzione della defecazione, flatulenza, orticaria e rossore;
  • Fratello: dolore all’addome, al collo e alla spalla, costipazione, dispepsia, flatulenza grave e febbre lieve.

In tutti e quattro si osservava un’eosinofilia cospicua, le analisi epatiche erano nella norma, non c’era alcuna anomalia al fegato, al pancreas e alla milza, e i test sierologici per Fasciola e Strongyloides risultarono negativi. Tra l’altro, tutti e quattro negarono di essere stati a contatto con animali erbivori ma ammisero di consumare regolarmente verdure fresche provenienti dai mercati locali o dal loro giardino; questo era stato fertilizzato con concime di pecora pochi mesi prima della comparsa dei sintomi.

La fascioliasi acuta fu diagnosticata sulla base della perdita di peso, dell’ipereosinofilia, della consumazione delle verdure e della residenza in una zona ad alto rischio. I medici spiegarono l’assenza di uova di Fasciola nelle feci e la negatività dei test sierologici rispettivamente dalla fase precoce della malattia e dall’eterogeneità della risposta anticorpale (o dalla degradazione dell’antigene).

I quattro individui vennero sottoposti a terapia con triclabendazolo (farmaco per la fascioliasi e la paragonimiasi) e un mese dopo accusavano gli stessi sintomi e presentavano di nuovo ipereosinofilia. Inaspettatamente, le tre sorelle mostrarono la presenza di uova di Trichostrongylus nelle feci, mentre il fratello era negativo. A questo punto vennero prelevati i campioni dagli altri membri della famiglia, e in quattro di essi (la madre e il padre, e la moglie e il figlio del fratello) furono distinte le uova di Trichostrongylus. Ventiquattro ore dopo il trattamento, nei campioni di feci si riscontrarono i vermi adulti di T. colubriformis e T. vitrinus. Questa diagnosi risultò imprevista, dal momento che, nonostante nell’Iran meridionale e centrale la prevalenza di Trichostrongylus fosse del 71%, recentemente erano stati descritti solo casi sporadici.

Metodi di identificazione

La diagnosi di tricostrongilosi si fonda prevalentemente sull’osservazione microscopica delle feci per ricercare le uova; queste hanno una forma ovale, allungata, appuntita a un’estremità o a entrambe, e misurano circa 85-115 μm. È necessario differenziare le uova di Trichostrongylus la quelle degli altri nematodi intestinali, che sono più piccole e non hanno le estremità appuntite (Fig. 6).

Uovo di T. colubriformis (A) a confronto con uova di Ascaris lumbricoides (B), Trichuris trichuria (C) e Ancylostoma duodenale (D) [Keyhan Ashraf et a., 2014 / https://www.researchgate.net/figure/Ancylostoma-duodenale-egg-with-larva_fig6_7226387 / https://www.researchgate.net/figure/Ascaris-lumbricoides-Trichuris-trichiura-hookworm-eggs-and-Strongyloidiasis_fig2_332164167]
Figura 6 – Uovo di T. colubriformis (A) a confronto con uova di Ascaris lumbricoides (B), Trichuris trichuria (C) e Ancylostoma duodenale (D) [Keyhan Ashraf et a., 2014 / https://www.researchgate.net/figure/Ancylostoma-duodenale-egg-with-larva_fig6_7226387 / https://www.researchgate.net/figure/Ascaris-lumbricoides-Trichuris-trichiura-hookworm-eggs-and-Strongyloidiasis_fig2_332164167]

Oltre alla ricerca delle uova, è possibile indurre la produzione delle larve al terzo stadio tramite coltura dei campioni fecali.

Tuttavia, l’esame microscopico non permette di discernere le specie di Trichostrongylus, e la coltura dei campioni fecali richiede parecchio tempo. Per questa ragione è utile l’impiego di metodiche molecolari basate sull’estrazione del DNA e l’amplificazione per PCR della regione ITS2 usando gli oligonucleotidi NC1 (5′-ACGTCTGGTTCAGGGTTGTT-3′) e NC2 (5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′). Successivamente si effettua il sequenziamento e l’analisi bioinformatica allineando e comparando le sequenze con i dati per Trychostrongylus spp. conservati in uno specifico database, per esempio GenBank.

In un articolo del 2018, pubblicato su American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, viene descritta l’identificazione di Trychostrongylus spp. mediante Real-Time PCR (PCR quantitativa, qPCR) con sonde TaqMan; in questo lavoro i ricercatori progettarono due oligonucleotidi per l’amplificazione (Tricho-F e Tricho-R, specifici per la regione codificante per l’RNA ribosomiale 5.8S e la regione ITS2) e altri due per il sequenziamento (JhTsp e Tricho-R) (Fig. 7).

Raffigurazione schematica di una parte dell’unita trascrizionale e le posizione dei primers utilizzati per l’amplificazione e il sequenziamento. 228 bp: dimensione del frammento amplificato. 76 bp: dimensione del frammento sequenziato [Francesca Perandin et al., 2018]
Figura 7 – Raffigurazione schematica di una parte dell’unita trascrizionale e le posizione dei primers utilizzati per l’amplificazione e il sequenziamento. 228 bp: dimensione del frammento amplificato. 76 bp: dimensione del frammento sequenziato [Francesca Perandin et al., 2018]

Una volta concluso il sequenziamento, le regioni 5.8S e ITS2 furono allineate con sequenze note presenti nel database GenBank. Esse mostravano una percentuale di identità che andava dal 99% al 100% per T. colubriformis e T. axei.

Le tecniche molecolari sono utili anche per eseguire una diagnosi differenziale; prendiamo come esempio uno studio del 2007, pubblicato su Korean Journal of Parasitology, che espone l’utilizzo della PCR allo scopo di differenziare il Trichostrongylus dall’A. duodenale e dal N. americanus. Gli scienziati isolarono il DNA da vermi adulti di T. colubriformis e clonarono la sequenza ITS1 (internal transcribed sequence 1), che venne poi sequenziata e comparata con quella delle altre due specie mediante il programma Clustal X. In seguito  estrassero il DNA dalle uova dei tre nematodi, sul quale realizzarono una PCR specie-specifica con tre coppie di oligonucleotidi che amplificarono la regione ITS1 (Fig. 8A). La reazione diede come risultato tre frammenti di diverse dimensioni (Fig. 8B).

L’immagine A mostra una rappresentazione schematica della sequenza dell’unità trascrizionale contenente ITS1 e ITS2. NC2 e NC5 sono i primers usati per l’amplificazione di ITS1 per il clonaggio, mentre jhTsp-NC2, JhAD-NC2 e jmNA-NC2 sono le tre coppie di primers per l’amplificazione di ITS1 nei tre nematodi. L’immagine B raffigura l’elettroforesi su gel d’agarosio dei tre prodotti di PCR, aventi un peso differente. La banda 1 è di N. americanus, la 2 di A. duodenale, la 3 di T. colubriformis [Tai-Soon Yong et al., 2007]
Figura 8 – L’immagine A mostra una rappresentazione schematica della sequenza dell’unità trascrizionale contenente ITS1 e ITS2. NC2 e NC5 sono i primers usati per l’amplificazione di ITS1 per il clonaggio, mentre jhTsp-NC2, JhAD-NC2 e jmNA-NC2 sono le tre coppie di primers per l’amplificazione di ITS1 nei tre nematodi. L’immagine B raffigura l’elettroforesi su gel d’agarosio dei tre prodotti di PCR, aventi un peso differente. La banda 1 è di N. americanus, la 2 di A. duodenale, la 3 di T. colubriformis [Tai-Soon Yong et al., 2007]

Terapia e profilassi

Per il trattamento della tricostrongilosi si consiglia il pirantel pamoato, un farmaco antielmintico tiofenico impiegato sia in campo umano che veterinario. Esso appartenente alla famiglia delle tetraidropiridine, molecole che vengono scarsamente assorbite dalla mucosa intestinale e che quindi hanno una bassa tossicità. Questo farmaco agisce come agonista dei recettori dell’acetilcolina e inibisce l’enzima colinesterasi; avviene così è un aberrante stimolazione gangliare colinergica sul sistema nervoso dei parassiti con conseguente depolarizzazione, contrattura muscolare, paralisi irreversibile, morte e staccamento dalla mucosa.

Ulteriori farmaci sono il mebedanzolo (Vermox) e l’albendazolo (Zentel), i quali agiscono rispettivamente bloccando la sintesi dei microtubuli e alterando la capacità di captazione e utilizzo del glucosio. In entrambi i casi l’effetto è la paralisi e la morte del parassita.

Per quanto concerne la prevenzione, consiste primariamente nel lavare bene le verdure prima di mangiarle, non bere acqua potenzialmente contaminata e utilizzare adeguate protezioni ogni volta che si sta a stretto contatto con animali da fattoria e quando ci si trova in aree dove c’è una certa prominenza del parassita.

Fonti

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  • Ralph Anna, OˈSullivan Matthew V N, Sangster Nicholas C, Walker John C. 2006. “Abdominal pain and eosinophilia in suburban goat keepers — trichostrongylosis”, Medical Journal of Australia
  • Strickland G. Thomas. 2000. “Hunter’s Tropical Medicine and Emerging Infectious Diseases”, WB Saunders Company
  • Tai-Soon Yong, Jong-Ho Lee, Seobo Sim, Jongweon Lee, Duk-Young Min, Jong-Yil Chai, Keeseon S. Eom, Woon-Mok Sohn, Soon-Hyung Lee and Han-Jong Rim. 2007. “Differential diagnosis of Trichostrongylus and hookworm eggs via PCR using ITS-1 sequence”, Korean Journal of Parasitology
  • Francesca Perandin, Elena Pomari, Camilla Bonizzi, Manuela Mistretta, Fabio Formenti, and Zeno Bisoffi. 2018. “Assessment of Real-Time Polymerase Chain Reaction for the Detection of Trichostrongylus spp. DNA from Human Fecal Samples”, Am. J. Trop. Med.
  • Issarapong Phosuk, Pewpan M. Intapan, Oranuch Sanpool, Penchom Janwan, Tongjit Thanchomnang, Kittisak Sawanyawisuth, Nimit Morakote, and Wanchai Maleewong. 2013. “Short Report: Molecular Evidence of Trichostrongylus colubriformis and Trichostrongylus axei Infections in Humans from Thailand and Lao PDR”, Am. J. Trop. Med.
  • Megumi Sato, Tippayarat Yoonuan , Surapol Sanguankiat, Supaporn Nuamtanong , Tiengkham Pongvongsa, Inthava Phimmayoi, Vilayphone Phanhanan, Boungnong Boupha, Kazuhiko Moji and Jitra Waikagul. 2011. “Short Report : Human Trichostrongylus colubriformis Infection in a Rural Village in Laos”, Am. J. Trop. Med.
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  • Shirzad Gholami, Farhang Babamahmoodi, Rohallah Abedian, Mehdi Sharif, Abbas Shahbazi, Abdolsattar Pagheh and Mahdi Fakhar. 2015. “Trichostrongylus colubriformis: Possible Most Common Cause of Human Infection in Mazandaran Province, North of Iran”, Iran J. Parasitology
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  • https://mediately.co/it/drugs/a90n345q9aCVXGYYlEwHhQ4dmda/vermox-100-mg-compresse#overdose
  • https://www.my-personaltrainer.it/farmaci/zentel.html
  • http://vetbook.org/wiki/rabbit/index.php/Trichostrongylus_spp
  • https://www.cdc.gov/dpdx/trichostrongylosis/index.html
  • https://www.researchgate.net/figure/Ancylostoma-duodenale-egg-with-larva_fig6_7226387
  • https://www.researchgate.net/figure/Ascaris-lumbricoides-Trichuris-trichiura-hookworm-eggs-and-Strongyloidiasis_fig2_332164167

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