Lo spettrofotometro

Caratteristiche generali dello spettrofotometro

Lo spettrofotometro (Fig. 1) è uno strumento di laboratorio basato sul principio che ogni molecola assorbe, trasmette o riflette luce (radiazione elettromagnetica) a una determinata lunghezza d’onda. Sapendo la lunghezza d’onda della luce che una determinata sostanza assorbe o trasmette, si possono fare analisi quanti-qualitative (presenza di determinate sostanze e la loro concentrazione nel campione in studio). Queste operazioni possono essere fatte perché lo strumento è in grado di analizzare la differenza d’intensità luminosa tra la luce prima e dopo essere passata attraverso il campione. È utilizzato in numerosi ambiti e lavora con lunghezze d’onda che vanno dal visibile all’ultravioletto (in alcuni strumenti anche gli infrarossi), permettendo così di valutare un range di campioni molto ampio.

Utilizzo in laboratorio

Lo spettrofotometro è utilizzato in moltissimi ambiti tra cui biologico, chimico, fisico e biochimico, ma ha anche applicazioni industriali e cliniche, oltre che nello studio dei materiali. Esso viene utilizzato per esaminare le caratteristiche dei vari campioni e, nello specifico, l’assorbanza delle sostanze in esame relativamente al loro spettro di assorbimento della luce (Fig. 2). Oltre alla misura di assorbimento di luce da parte di una sostanza, possono essere fatte anche misure sulla concentrazione attraverso analisi:

Qualitative sulla presenza o meno di una determinata sostanza caratterizzata da uno specifico spettro di assorbimento;
Semi quantitative, mettendo in rapporto le concentrazioni stimate di diversi campioni definendo quelle più ricche o povere di una determinata sostanza;
Quantitative, ovvero la stima del contenuto di una certa molecola.

In quest’ultimo caso è necessario compilare una curva di calibrazione e avere a disposizione degli standard con una concentrazione nota, così da poterli mettere in relazione con i dati ottenuti. Un’applicazione di questo strumento è quella di analizzare il contenuto di determinati nutraceutici (antociani, polifenoli…) e di clorofilla in campioni di prodotti vegetali per valutarne la qualità.

Spettro di assorbimento della clorofilla a e b — *Figura 2 – Spettro di assorbimento della clorofilla a ( in verde) e della clorofilla b (in blu); (fonte wikipedia common).*

Funzionamento dello spettrofotometro

Lo spettrofotometro è costituito generalmente da una fonte di luce, una lampada, che cambia tipologia in caso si tratti delle analisi nello spettro visibile o UV e, in alcuni strumenti specifici, i raggi infrarossi. La luce passa, successivamente, attraverso un monocromatore, ovvero un dispositivo che scompone la luce policromatica in fasci di luce di singole lunghezze d’onda. Poi il raggio di luce passa da una provetta contenente il campione, la cuvetta (Fig. 3); quest’ultima è di misura standard e prodotta di materiale plastico o quarzo, a seconda delle radiazioni da valutare.

*Figura 3 – Cuvette in plastica per analisi nello spettro visibile (Fonte Beatrice Cavenago)*

Il raggio luminoso (Fig. 4) che entra nel campione sarà differente da quello in uscita perché in parte è stato assorbito. Alla fine è posizionato un fotometro che rileva la quantità di fotoni che sono stati assorbiti e manda le informazioni al display dello strumento o a un pc. Lo strumento può fare delle misure in un intervallo di lunghezze d’onda, dare il dato richiesto a una sola lunghezza d’onda impostata o analizzare tutto lo spettro d’assorbimento. Spesso è possibile fare le misure a freddo in quanto la maggior parte degli spettrofotometri hanno un sistema di raffreddamento così da evitare la degradazione dei campioni. È fondamentale che tra i campioni, nelle apposite posizioni, ci siano delle cuvette con il “bianco” (cuvetta con soluzione senza molecole d’analizzare), così da poter tarare lo spettrofotometro allo zero di assorbanza.

Schema di funzionamento spettrofotometro — *Figura 4 – Funzionamento dello spettrofotometro schematizzato (Fonte Beatrice Cavenago)*

Teoria del funzionamento dello spettrofotometro

Il parametro che lo spettrofotometro è in grado di valutare è l’assorbanza (A) che viene definita dalla formula:

A=log(I_o/I_t)

Dove I₀ e I_t sono l’intensità di luce, rispettivamente, prima del campione (incidente) e trasmessa. L’assorbanza è un valore senza unità di misura che va da 0 (luce trasmessa uguale a quella in entrata) a 2 (luce trasmessa è 1/100 di quella incidente). L’assorbanza segue la legge di Lambert e Beer che afferma che la concentrazione del campione nella cuvetta è proporzionale alla sua assorbanza.

A= εcl

ε è il coefficiente di estinzione molare (M^-1cm^-1), ovvero una costante che varia a seconda delle caratteristiche della sostanza. Essa varia a seconda della lunghezza d’onda incidente e indica la capacità di una sostanza di assorbire la data radiazione;
c è la concentrazione molare del campione nella cuvetta (M);
l è il cammino ottico, ovvero la lunghezza della cuvetta (cm).

Limiti dello strumento

I limiti dipendono dal modello di spettrofotometro e dalle sue caratteristiche specifiche e sensibilità ma anche dalla precisione dell’operatore nelle operazioni precedenti all’analisi stessa. Per una buona misurazione i campioni devono essere puliti e senza residui grossi o impurità. È importante che le cuvette siano perfettamente pulite nei lati dove passa la luce per evitare fenomeni di assorbimento o riflessioni di luce errati. Per di più è necessario conoscere la lunghezza d’onda della luce assorbita dalle molecole che si stanno cercando così da poter impostare lo strumento nella maniera corretta, nel caso di analisi a singola lunghezza d’onda. Nel caso in cui la composizione del campione sia ignota si può osservare lo spettro totale e, successivamente, analizzare i singoli picchi nel grafico per determinare le molecole presenti.

Precauzioni di utilizzo

Lo spettrofotometro è uno strumento sicuro che non necessita particolari dispositivi di protezione per l’operatore durante l’utilizzo. Le precauzioni vanno prese in base alle sostanze che si vanno ad analizzare, in caso siano tossiche o pericolose.