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Endofiti: una svolta in agrotecnica e salute?

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Gli endofiti delle piante sono in grado di produrre alcune delle molecole tipiche del metabolismo delle piante stesse. Questa caratteristica apre nuove strade di ricerca nel campo delle biotecnologie per un futuro più sostenibile.

Saccharomyces cerevisiae

Produzione di (2 S)-Naringenina in Saccharomyces cerevisiae – (Parte 2)

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Saccharomyces cerevisiae è un lievito, molto utilizzato nell’ingegneria metabolica (più di Escherichia coli) per 3 motivi principali:

  • È considerato dalla Food e Drug Administration (FAD) degli Stati Uniti come un organismo G.R.A.S, ovvero un organismo generalmente considerato sicuro, in altre parole permette la produzione di molecole sicure e consumabili dall’uomo.
  • Presenta una somiglianza filogenetica con le piante; pertanto, se in questo ceppo vengono messi nella giuste condizioni, gli enzimi che risiedono nelle piante possono funzionare con la stessa efficienza anche in questo microrganismo.
  • Esprimono degli enzimi che fanno parte del complesso del citocromo P450, il quale permette il corretto svolgimento delle razioni che avvengono nella via del fenilpropanoide. Di conseguenza, permette la creazione di flavonoidi.

Nel corso del tempo, molti lavori si sono basati sul tentativo di realizzare una produzione di flavonoidi, ma tutti hanno avuto basse rese di produzione, concludendo che ci sono dei fattori limitanti ignoti che riducono le quantità di produzione.

Produzione di (2S)-NARINGENINA

In un recente studio condotto sulla produzione del flavanone (2S)-naringenina, i ricercatori si sono domandati se una volta individuati i fattori limitanti e costruendo una via bio-sintetica della (2S)-naringenina all’interno di Saccharomyces cerevisiae, sia possibile, poi, riuscire ad effettuare una produzione in scala industriale di questa molecola. Per rispondere a questa domanda, hanno ingegnerizzano questo microrganismo mediante l’utilizzo di geni eterologhi (geni che provengono da altri organismi), i quali codificano per gli enzimi della via biosintetica del fenilpropanoide:

  • Flavobacterium  jhonsoniae: FJ TAL;
  • Petroselielum crispum: PC 4CL;
  • Petunia X hybrida: PH CHS;
  • Medicago sativa: MS CHI.
l'enzima calcone isomerasi permette la produzione di (2S)-naringenina, un flavonoide.
Enzima Calcone Isomerasi (CHI)
Figura 3 - Calcone Isomerasi - codice: 4D06; Calcone Sintasi - codice: 6DXA
Enzima Calcone Sintasi (CHS)
Figura 3 – Calcone Isomerasi – codice: 4D06; Calcone Sintasi – codice: 6DXA [Fonte: PDB.com
Rappresentazione grafica: Chimera]
Figura 4 - Focus sull'enzima Calcone Isomerasi che lega con i suoi residui la (2S)-naringenina (in viola)
Figura 4 – Focus sull’enzima Calcone Isomerasi che lega con i suoi residui la (2S)-naringenina (in viola)
[Fonte: PDB.com; codice:4D06; Rappresentazione grafica: Chimera]

Esperimento di produzione

I ricercatori hanno inserito i geni eterologhi all’interno dei plasmidi, i quali, successivamente, sono stati introdotti in E. coli. All’interno di questo batterio è avvenuta la trasformazione, l’amplificazione e la conservazione del DNA plasmidico modificato. Dopodiché, i plasmidi sono stati immessi all’interno di Saccharomyces cerevisiae mediante il metodo dell’acetato di litio che causa la permeabilizzazione della membrana citoplasmatica del lievito, permettendo quindi l’ingresso dei plasmidi all’interno della cellula. Per verificare la corretta introduzione dei plasmidi, gli scienziati hanno effettuato il sequenziamento di Sanger. Il lievito, una volta ingegnerizzato, ha preso il nome di Saccharomyces cerevisiae Y100, e in seguito il ceppo modificato è stato inoculato all’interno di un terreno di coltura sintetico Drop-Out composto da:

  • 20 g/L di Glucosio
  • 1,75 g/L di basi azotate
  • 5 g/L di ammonio solfato
  • 50 mg/L di amminoacidi (leucina, triptofano e istidina)

Le colonie cresciute all’interno di questo terreno sono state, successivamente, inoculate all’interno di un bioreattore di vetro da 5 L che conteneva un terreno di coltura YPD (estratto di lievito, peptone e destrosio) ed incubato per 72 ore a 30°C.

Risultato dell’esperimento

La via del fenilpropanoide, bio-ingegnerizzata in saccharomyces cerevisiae Y100 (Fig. 5), parte dal glucosio, il quale, attraverso la glicolisi e via dei pentosi fosfati, viene trasformato rispettivamente in fosfoenol-piruvato ed eritrosio 4-fosfato. Questi due metaboliti, di conseguenza, entreranno nella via dello shikimato condensando grazie all’azione dell’enzima DAHP sintasi, codificato dal gene ARO4, che lo trasforma in Acido 3-deossi D-arabino eptulosonico 7-fosfato (DAHP). Successivamente, il DAHP reagisce con l’enzima 3-fosfo shikimato 1-carbossi vinil trasferasi, codificato da ARO1, che lo trasforma in 5-enol piruvil shikimato 3-fosfato (EP3P). In seguito, l’EP3P reagirà con l’enzima corismato sintasi, codificato da ARO2, che lo trasforma in corismato, il quale reagisce con l’enzima Corismato mutasi, codificato da ARO7, che lo converte in Prefanato.

Il prefanato reagisce con l’enzima prefanato deidrogenasi, codificato da TYR1, generando la Tirosina. Dipoi, la Tirosina entra nella via del fenilpropanoide, dove viene trasformata dall’enzima FJ-TAL in acido p-cumarico, il quale sarà trasformato in p-cumaroil-CoA da parte dell’enzima PC-4CL. Dopodiché, il p-cumaroil-CoA reagisce con l’enzima Sm-CHS2 (calcone sintasi di Silybium marianum) diventando Calcone–naringenina che reagirà, a sua volta, con l’enzima Ms-CHI (calcone isomerasi di Medicago sativa) diventando (2S)-naringenina.

I risultati ottenuti dalla via biosintetica ingegnerizzata inizialmente sono stati molto scarsi, ottenendo una produzione totale di 63,25 mg/L della molecola, pertanto, sono stati fatti dei miglioramenti attuando delle modifiche su alcuni enzimi. Un esempio è la soppressione e la sovra-espressione di determinati geni implicati nella via del fenilpropanoide, che hanno dato negli altri ceppi mutanti di Saccharomyces cerevisae (ceppo Y205,Y206 e Y207) una produzione totale di 648,63 mg/L di (2S)-naringenina (Fig 6).

Figura 5 - Via di sintesi della (2S)naringenina in saccharomyces cerevisiae
Figura 5 – Via di sintesi della (2S)naringenina in Saccharomyces cerevisiae [https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.jafc.9b05218]
Figura 6 - Grafico che rappresenta i miglioramenti della via biosintetica in saccharomyces cerevisiae ceppo Y207. 1 grafico: (2S)naringenina prodotta in 60 ore 2 grafico: crescita cellulare (densità ottica OD600) in 60 ore 3 grafico: velocità e tempo di consumo di acido p-cumarico aggiunto al bio-reattore.
Figura 6 – Grafico che rappresenta i miglioramenti della via biosintetica in Saccharomyces cerevisiae ceppo Y207.
1 grafico: (2S)naringenina prodotta in 60 ore 
2 grafico: crescita cellulare (densità ottica OD600) in 60 ore 
3 grafico: velocità e tempo di consumo di acido p-cumarico aggiunto al bio-reattore.
[https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.jafc.9b05218]

Fattori limitanti

La creazione della via biosintetica per la produzione della (2S)-naringenina ha fatto notare ai ricercatori la presenza di fattori che limitavano la produzione della molecola. Pertanto, risolvendo queste limitazioni è possibile migliorarne il processo:

  • L’enzima Calcone sintasi (CHS) influenza la produzione della (2S)-naringenina, che possiede un’efficienza che varia da specie in specie; dunque, per risolvere questo limite, bisognerebbe individuare la specie che possiede un CHS più efficiente ed aumentare il suo numero di copie.
  • Il malonil-CoA limita la produzione della (2S)-naringenina, poiché nel processo servono 3 molecole. Un modo per risolvere questa problematica è quella di aumentare i livelli di malonil-CoA mediante la sovra-espressione dei geni che codificano gli enzimi che lo producono come piruvato decarbossilasi, acetaldeide deidrogenasi e acetil-CoA carbossilasi.

Fonti

flavonoidi

Produzione dei flavonoidi in Saccharomyces cerevisiae (Parte 1)

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I flavonoidi sono delle molecole che appartengono a una classe di metaboliti secondari sintetizzati ubiquitariamente in tutto il regno vegetale, caratterizzati da una struttura polifenolica. Questa classe di molecole presentano molteplici attività biomediche come:

  • Antiossidanti
  • Antitumorali
  • Antimutagene
  • Antibatteriche
  • Antinfiammatorie
Figura 1 - Struttura generale dei flavonoidi
Figura 1 – Struttura generale dei flavonoidi [https://www.tuscany-diet.net]

Per tanto, queste molecole hanno attirato l’attenzione di molte industrie, in particolare farmaceutiche, nutraceutiche e alimentari per la produzione di farmaci ed integratori alimentari a base di flavonoidi.

I flavonoidi presentano una struttura chimica caratterizzata da 3 anelli dove quelli esterni sono anelli benzoici e contengono sei atomi di carbonio (Fig. 1; anello: A e B), mentre l’anello centrale è eterociclico composto da 3 atomi di carbonio (Fig. 1; anello: C). Queste molecole sono suddivise in sei categorie principali che si differenziano per diverse caratteristiche come ad esempio la saturazione di legame, l’idrossilazione e il posizionamento degli anelli aromatici:

  • Flavononi
  • Flavoni
  • Isoflavoni
  • Flavonoli 
  • Catechine
  • Antociani

Queste molecole svolgono molteplici funzioni all’interno delle piante, tra cui:

  • Conferiscono colore alle piante;
  • Proteggono dai raggi UV ;
  • Partecipano nella sintesi simbiotica dell’azoto;
  • Agiscono come messaggeri o regolatori nel ciclo cellulare.

Dunque, per produrre in scala industriale queste molecole, bisogna prima identificare la loro biosintesi naturale che avviene nelle piante.

Biosintesi nelle piante

La via biosintetica dei flavonoidi nelle piante prende il nome di via del fenilpropanoide (Fig. 2), dove il metabolita primario è il glucosio, il quale, attraverso la glicolisi oppure attraverso la via dei pentosi fosfato, viene trasformato in Fosfoenolpiruvato (PEP) ed Eritrosio 4 fosfato (E4P). Questi due prodotti reagiscono per generare l’acido shikimico, il quale, una volta formato, entra nella via del Shikimato.

Inizio della reazione

Attraverso questa via l’acido shikimico viene trasformato in L-fenilanalina e L-tirosina, dopodiché i due amminoacidi entreranno nella via del fenilpropanoide. L-fenilelanina reagisce con l’enzima Fenilalanina Ammoniaca Liasi (PAL), che la converte in acido Cinnamico; quest’ultimo reagirà, successivamente, con l’enzima acido cinnamico 4 idrossilasi trasformandolo in Acido p-cumarico. La tirosina, invece, segue una via diretta e viene trasformata subito in Acido p-cumarico dall’azione dell’enzima Tirosina Ammoniaca Liasi (TAL).

Una volta creato l’acido p-cumarico, quest’ultimo reagisce con l’enzima 4-Cumarol-CoA Ligasi (4CL) e diventa in p-cumaroil-CoA, che in seguito reagirà con 3 molecole di Malonil-CoA attraverso l’enzima Calcone Sintasi (CHS). Tale passaggio porterà alla genesi del Calcolone, che è il precursore chiave per la produzione dei diversi sottogruppi dei flavonoidi.

Fine della reazione

Il Calcolone subisce prima una reazione di Isomerizzazione effettuata dall’enzima Calcone Isomerasi (CHI), che causa la chiusura dell’anello centrale, formando il Flavonoide. Infine, quest’ultima molecola subisce diverse reazioni enzimatiche come idrossilazione, trans-amminazione e ossido-riduzione, che porteranno alla produzione di diverse molecole appartenenti alla famiglia dei flavonoidi.

Figura 2 - Via del fenilpropanoide nelle piante
Figura 2 – Via del fenilpropanoide nelle piante [https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.jafc.9b05218]

Metodi di produzione

Le molteplici proprietà che possiedono queste molecole hanno portato nel corso del tempo a un aumento di interesse a livello aziendale per una produzione in larga scala, sviluppando diverse tecniche, come i metodi chimici, i metodi per estrazione e purificazione delle piante e il metodo bio-ingegneristico.

Metodi Chimici

Questi metodi consentono una produzione sintetica di flavonoidi, ottenendo una classe specifica pura. Tuttavia, queste molecole vengono sintetizzate mediante l’utilizzo di reazioni in condizioni estreme come alta temperatura, acidi e basi forti, metalli pesanti e sostanze chimiche tossiche. Pertanto questo tipo di tecnica non è stata considerata idonea per la fabbricazione industriale, dal momento che impatta gravemente l’ambiente, la produzione è minima, e inoltre, non sono stereoisomeri, quindi non biologicamente attive.

Metodi per estrazione e purificazione dalle piante

E’ la metodologia più utilizzata, poiché permette di ottenere una miscela di composti di flavonoidi biologicamente attivi, anche se la separazione nelle diverse classi di queste molecole necessita l’impiego di tecniche purificanti molto costose e che impattano notevolmente sull’ambiente. Tra l’altro, una delle sfide principali riguarda proprio le cellule vegetali che tendono a formare aggregati cellulari; questi possono influenzare l’attività enzimatica della coltura degli enzimi coinvolti nella via del fenilpropanoide a causa della formazione di zone d’ombra tra i diversi strati di cellule, dato che l’attività di questi enzimi è dipendente dalla luce. Di conseguenza, se l’attività enzimatica è compromessa, si otterrà una molecola flavonoide di bassa qualità con poca efficienza.

Metodo bio-ingegneristico

Questa nuova e innovativa tecnica consente di ottenere molecole biologicamente attive e pure (in termini di classe flavonoica) tramite l’utilizzo di microrganismi ospiti come Escherichia Coli, Saccharomyces cerevisiae e Yarrowia lipolytica. L’ingegnerizzazione di microrganismi ospiti viene adoperata per i seguenti motivi: hanno rapidi tassi di crescita, sono facili da coltivare, possono essere modificati geneticamente, sono tecniche economiche che non prevedono l’utilizzo di molta energia e reagenti chimici tossici.

Fonti

Farmafood: il cibo che fa bene

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L’alimento umano è il fondamento della cultura e del sentimento. Se volete far migliorare il popolo, in luogo di declamazioni contro il peccato, dategli un’alimentazione migliore. L’uomo è ciò che mangia.

Il fiore è la struttura delle piante che ne permette la riproduzione. Costituisce, infatti, la sede degli organi riproduttivi femminili (pistilli) e maschili (stami). Possono avere diverse conformazioni e costituire infiorescenze.

Il fiore: morfologia

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Il fiore costituisce una struttura importante per le piante poiché ne permette la riproduzione; è la sede degli organi riproduttivi femminili (femminili) e maschili (stami) e svolge un’importante funzione di attrazione degli impollinatori.