Agar sangue tellurito

Utilizzo

L’agar sangue tellurito è un terreno di coltura parzialmente selettivo e differenziale per l’isolamento di Corynebacterium diphtheriae in campioni clinici. C. diphtheriae, identificato per la prima volta nel 1884 da Edwin Klebs e da Friedrich Löffer, è un batterio patogeno Gram positivo, nonché agente eziologico della difterite.
Esistono diversi biotipi di questi batteri, diversi da un punto di vista morfologico e biochimico:

  • gravis;
  • mitis;
  • intermedius;
  • hofamannii;
  • xerosis;
  • belfanti.

Ad eccezione del biotipo “belfanti“, tutti gli altri sono in capaci di liberare la tossina difterica.
C. diphtheriae ha una forma bastoncellare con estremità a clava (Fig.1), di lunghezza compresa tra l’1 e gli 8 micron, nei campioni infetti assume forma caratteristica a “V” o ad “ideogrammi cinesi”, ed è aerobio/anaerobio facoltativo. Inoltre, è immobile, acapsulato e catalasi positivo.
La tossina difterica, oltre a danneggiare le vie aeree superiori, può favorire l’insorgenza di complicazioni a livello cardiaco, nervoso e renale.

C. diphtheriae, bastoncellari con estremità a clava
Figura 1 – C. diphtheriae, bastoncellari con estremità a clava [Fonte: lookfordiagnosis.com]

Composizione del terreno

Il terreno di colturaBD Tellurite Agar (Hoyle)“, noto come “Agar sangue tellurito“, deriva da una modifica del terreno di coltura sviluppato da Neill per l’isolamento di C. diphtheriae e consente la crescita di tutti i differenti biotipi.
Contiene estratto di carne e peptone che forniscono azoto e fattori di crescita, mentre il cloruro di sodio garantisce il mantenimento dell’equilibrio osmotico. L’aspetto nutrizionale è completato dall’aggiunta del sangue lisato di cavallo.
Il tellurito di potassio alle concentrazioni del terreno inibisce lo sviluppo dei batteri Gram negativi e della maggior parte dei Gram positivi permettendo, al contrario, di osservare la riduzione del tellurito tipica dei corinebatteri.

La formula sviluppata per “l” di acqua purificata è riportata in Tabella 1 e può essere compensata/corretta per soddisfare i propri criteri di performance:

ReagentiQuantità
Estratto di carne10,0 g
Peptone10,0 g
Cloruro di sodio5,0 g
Tellurito di potassio0,35 g
Sangue di cavallo defibrinato e lisato7%
Agar15,0 g
Tabella 1: formula per lo sviluppo del terreno “Agar sangue tellurito” [Fonte: Scheda tecnica BD]

Il pH del mezzo finale è di circa 7,8. Bisogna conservato al buio a temperature di 2-8 °C fino alla data di scadenza riportata.

Metodo

E’ necessario seminare il campione sul terreno di coltura, appena giunto in laboratorio. Le piastre vanno poi incubate in aerobiosi o in atmosfera aerobica arricchita di biossido di carbonio a 35-37°C per 24-72 h. La lettura deve essere fatta ad intervalli di 24-48-72 h dalla semina.
Per la differenziazione è necessario eseguire una colorazione (es. colorazione Neisser) dal campione o da slant di siero Löffer, inoculati con il campione o con una coltura di ceppo isolato.

Risultati della crescita

Sul terreno “Agar sangue tellurito” C. diphtheriae produce colonie dal grigio al nero che possono poi essere ispezionate con lente di ingrandimento per la determinazione dei diversi biotipi.

  • C. diphtheriae biotipo gravis: colonie grigie opache, leggermente convesse e con bordi lobati.
    • mitis: colonie grigie lucenti con bordi uniformi, spesso si osservano colonie di diverse dimensioni.
    • intermedius: colonie grigie e lucenti con centro dal grigio scuro al nero, piccole.
    • hofmannii: colonie isolate dal bianco al grigio, in aree di crescita confluente possono assumere colorazione nera.
    • xerosis: colonie nere lucenti.

Se si utilizza la colorazione di Neisser, i corinebatteri appaiono come contenenti granuli metacromici, tuttavia, sono richiesti ulteriori test biochimici per la conferma.
Tutti gli isolati devono essere verificati per la produzione della tossina difterica.

Immagini

Esempi di crescita sul terreno di coltura si possono osservare in figura 2 e figura 3:

Colonie di C. diphtheriae su agar sangue tellurito, grigie opache con bordi uniformi
Figura 2 – Colonie di C. diphtheriae su agar sangue tellurito, grigie lucenti con bordi uniformi [Fonte: plastlabor.com.br]
Colonie di C. diphtheriae su agar sangue tellurito, aspetto grigio opaco e bordi da regolari a lobati
Figura 3 – Colonie di C. diphtheriae su agar sangue tellurito, aspetto grigio opaco e bordi da regolari a lobati [Fonte: flickr]

Limitazioni

Il terreno “Agar sangue tellurito” è parzialmente selettivo e differenziale per l’identificazione e l’isolamento di C. diphtheriae in campioni clinici, tuttavia, sono richiesti ulteriori test di conferma, dal momento che altri microrganismi possono sviluppare colonie simili a quelle dei corinebatteri e relativi biotipi. Per tale ragione, la diagnosi non deve essere esclusivamente basata sull’utilizzo del terreno, ma richiedere test immunologici e di rilevamento della tossina.

Controllo qualità

Come controllo di qualità è possibile inoculare sul terreno di coltura i ceppi riportati in Tabella 2:

CeppiRisultati della crescita
Corynebacterium diphtheriae ATCC 9675Crescita da buona ad eccellente, colonie medio-piccole, dal grigio scuro al nero
Corynebacterium diphtheriae ATCC 11913Crescita da buona ad eccellente, colonie medie, dal grigio scuro al nero
Escherichia coli ATCC 25922Inibizione da parziale a completa
Staphylococcus aureus ATCC 25923Inibizione da parziale a completa
Non inoculatePiastre rosse, leggermente opache
Tabella 2 – Parametri del controllo qualità [Fonte: Scheda tecnica BD]

Fonti

Crediti tabelle
Crediti immagini
Foto dell'autore

Giulia Baldi

Biologa A iscritta all'albo professionale. Laureata in Scienze Biologiche e in Biologia Agro-Ambientale con tirocini in ambito clinico (laboratorio di microbiologia e virologia) e ambientale (laboratorio di ricerca in interazioni pianti-ambiente). Master di II livello in Sicurezza Alimentare e Sistemi di Gestione.

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