COVID-19, test diagnostico: come si esegue?

Il COVID-19 è una malattia infettiva che provoca una grave sindrome respiratoria acuta, causata dal virus SARS-Cov-2.

In particolare, gli individui affetti da tale patologia presentano sintomi quali febbre, tosse e fiato corto.

Diagnosi COVID-19

La diagnosi di COVID-19, in caso di sintomi sospetti, si effettua mediante raccolta di un campione da tampone rinofaringeo o orofaringeo.

Tampone
Figura 1 – tampone [credits: serchioindiretta.it]

Tampone rinofaringeo

Il tampone viene inserito abbastanza in profondità nella cavità nasale, quindi, viene spostato delicatamente in avanti fino al rinofaringe, ruotandolo per un certo tempo al fine di raccogliere le secrezioni contenenti eventualmente il virus.

Tampone rinofaringeo per la diagnosi di COVID-19
Figura 2 – tampone rinofaringeo per la diagnosi di COVID-19 [credits: regione.lombardia.it]

Successivamente, è posto in un mezzo sterile, un buffer (ovviamente, privo di inibitori eventuali di PCR) e viene spedito in laboratorio.

PCR

La metodica standard per l’individuazione di Sars-Cov-2 si avvale dell’utilizzo di una normale reazione di PCR.

PCR
Figura 3 – PCR [credits: genomeup]

Specificamente, facciamo riferimento ad una tecnica ampiamente utilizzata in biologia molecolare che permette di ottenere molteplici copie di uno specifico frammento di DNA. In particolare, il Coronavirus è un virus ad RNA a singolo filamento molto lungo e la sua identificazione avviene proprio mediante la ricerca dell’RNA virale. Pertanto, si ricorre ad una RT-PCR (nella fattispecie, prima la Reverse Transcriptase PCR e poi la Real time PCR). In questo modo, l’RNA virale viene inizialmente convertito in cDNA, DNA complementare all’RNA virale, attraverso l’enzima trascrittasi inversa. Il prodotto di tale reazione sarà un ibrido RNA/DNA. Dopo l’allontanamento dell’RNA virale, il cDNA verrà utilizzato per l’amplificazione tramite PCR classica. Però, prima di procedere con le due tecniche di PCR, l’RNA virale è sottoposto ad estrazione e purificazione.

Estrazione

Come prima cosa, il campione viene posto in un tubo da micro-centrifuga e poi miscelato con un lysis buffer (soluzione altamente denaturante, contenente reagenti capaci di lisare facilmente la superficie del virus). Una volta inserito il buffer nel campione e riposto il tutto in una provetta, il contenuto di quest’ultima viene miscelato attraverso l’utilizzo di un vortex per poi essere incubato a temperatura ambiente.

Purificazione

Tale processo avviene utilizzando una spin column (colonna di purificazione contenente una resina specifica). In questa colonna è presente:

  • una fase stazionaria costituita da una resina;
  • una matrice di gel di silice (a condizioni di pH ottimali per l’RNA virale). Essa trattiene fortemente le molecole di RNA.

In questo modo, il filtro della spin column legherà solo le molecole di RNA. In seguito a centrifugazione, la colonnina viene posta in un tubo pulito, mentre il filtrato viene scartato. Successivamente, alla colonnina viene aggiunto un wash buffer, effettuando così tutta una serie di lavaggi di maniera tale da rimuovere eventuali residui rimasti intrappolati. Dunque, il campione è nuovamente sottoposto a centrifugazione. Così facendo, si ottiene il solo RNA virale legato al gel di silice della spin column. Dopo un ulteriore lavaggio, al campione si aggiunge un un elution buffer, ovvero un tampone di eluizione, così da determinare il rilascio dell’RNA virale. A questo punto, si sottopone nuovamente il tutto a centrifugazione. Ora, l’RNA virale è stato estratto e purificato.

Real time e reverse transcriptase PCR

A questo punto, l’RNA virale (lo stampo primario) sarà utilizzato per la reverse transcriptase PCR così da da ottenere uno stampo secondario, ovvero il cDNA. Quindi, il cDNA sarà amplificato mediante real time PCR. Pertanto, si può passare ad allestire la miscela di reazione per l’amplificazione delle sequenze virali tramite PCR.

Cosa succede nel particolare?
Amplificazione tramite PCR
Figura 4 – Amplificazione tramite PCR [credits: multimed.it]

Innanzitutto, viene utilizzato un master mix, una soluzione già pronta costituita da:

  • trascrittasi inversa;
  • nucleosidi trifosfato (dNTPs);
  • primers reverse e forward;
  • TagMan probe e DNA polimerasi.

Come prima cosa, il campione di RNA estratto e purificato viene inserito in una provetta contenente la soluzione master mix, per poi essere sottoposto a miscelazione mediante vortex. In seguito, si carica la miscela di reazione in una piastra per PCR che sarà, quindi, inserita in una macchina per PCR. Specificamente, parliamo di un termociclatore programmato prima per la RT-PCR e poi per la real time PCR. Inoltre, tale macchinario è opportunamente settato per amplificare i geni target di SARS-Cov-2, ovvero: i geni RdRP, E ed N. Chiaramente, la scelta di questi geni dipenderà dalle sequenze dei primers e della sonda TagMan utilizzate.

Step sequenziali

Il primo step operato dall’apparecchio è quello della retro-trascrizione. In particolare, la sintesi di cDNA avviene grazie al primer che va ad ibridarsi alla sequenza complementare dell’RNA virale e che viene allungato dall’enzima trascrittasi inversa, in direzione 5′-3′. Dipoi, si esegue una denaturazione iniziale di maniera tale che si denaturi l’ibrido cDNA-RNA virale e che si abbia simultaneamente l’attivazione della DNA polimerasi e l’inattivazione della trascrittasi inversa. Quindi, si passa all’azione della DNA polimerasi che polimerizza l’altro filamento complementare del cDNA che è stato retro-trascritto. Dopodiché, si può proseguire con la vera e propria amplificazione del cDNA a doppio filamento mediante real time PCR.

Step di amplificazione

L’individuazione del DNA virale si ottiene in tre cicli essenziali, ciascuno caratterizzato da:

  1. denaturazione;
  2. annealing;
  3. extension.
Primo ciclo

Nel primo ciclo si avrà la denaturazione del cDNA, l’annealing (legame) tra i primers della miscela e la singola elica di cDNA denaturato e l’extension (allungamento) della sequenza di cDNA grazie ai dNTPs e la DNA polimerasi presenti nella miscela. A questo punto, non interverrà più la trascrittasi inversa, ma la Taq polimerasi. Alla fine, si otterrà la prima molecola di DNA bersaglio a doppia elica (corrispondente, chiaramente, all’RNA di SARS-Cov-2).

Secondo ciclo

Nel secondo ciclo si avrà ancora la denaturazione del cDNA e l’annealing tra le sonde della miscela e ciascuna delle due singole eliche di DNA stampo complementare ai geni target. In aggiunta a ciò, si avrà anche l’annealing della sonda TagMan probe alla sequenza complementare del DNA bersaglio. Nella successiva fase di extension, la DNA polimerasi che sintetizzerà le nuove doppie eliche di DNA, scorrendo lungo i singoli filamenti, grazie alla sua attività esonucleasica, degraderà anche la TagMan probe. Così facendo, sonda quencher e fluoroforo verranno separati ed il fluoroforo inizierà ad emettere fluorescenza.

Terzo ciclo

Nel terzo ciclo e così via nei cicli successivi, si avrà ulteriore denaturazione delle eliche di cDNA, ulteriore annealing tra le sonde ed i geni target ed ulteriore extension per cui si avrà nuova sintesi di frammenti complementari. In questo modo, alla fine, saremo in grado di rilevare o meno la presenza dell’RNA virale di SARS-Cov-2.

Giovanna Spinosa

English version here

Fonti
  • https://etd.adm.unipi.it/t/etd-09172021-123453/;
  • http://www.omceopr.it/wp-content/uploads/2020/03/NOTA-SULLA-DIAGNOSTICA-COVID-E-SICUREZZA-DEI-TEST-.pdf;
  • https://www.ordinefarmacistigr.it/documenti/circolarifofi/2020/12616.pdf.
Crediti delle immagini
  • Figura 1: https://www.serchioindiretta.it/cronaca/2021/12/20/coronavirus-87-nuovi-positivi-in-provincia-di-lucca-8-sono-in-valle-del-serchio/132892/;
  • Figura 2: https://www.regione.lombardia.it/wps/portal/istituzionale/HP/lombardia-notizie/DettaglioNews/2020/08-agosto/a/19-08-2020-aeroporto-malpensa-tamponi;
  • Immagine 3: https://www.genomeup.com/Glossary/pcr/;
  • Immagine 4: https://www.multimed.it/blog/blog/salute/tampone-molecolare-covid-19-tutto-quello-che-c-e-da-sapere.

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