Test di conta di Howard Lam

Interesse alimentare

Le muffe si possono sviluppare comunemente sugli alimenti come frutta, formaggi, prodotti da forno e anche verdure.
Si tratta di microrganismi appartenenti al Regno dei Funghi e che si sviluppano normalmente a temperature comprese tra i 15 e i 30 gradi, con umidità superiore al 65% e con pH compreso tra 4 e 8.
Sono anche definiti “funghi filamentosi” poichè, dalle spore disperse nell’aria, si sviluppano successivamente (in condizioni più favorevoli) dei filamenti noti come “ife”, i quali tendono ad aggrovigliarsi tra di loro per formare un’ulteriore struttura nota con il nome di “micelio” (Fig.1).
Per questo si distinguono dai lieviti che, al contrario, presentano singole cellule dalla forma ovoidale.

A sinistra sono raffigurate cellule singole di lievito dalla forma ovoidale, mentre a destra sono rappresentate le numerose ife fungine di un fungo filamentoso
Figura 1 – A sinistra sono raffigurate cellule singole di lievito dalla forma ovoidale, mentre a destra sono rappresentate le numerose ife fungine di un fungo filamentoso. [Fonte: MedLine Plus]


Svariate muffe sono notoriamente utili in campo alimentare, come Penicillium nalgiovense (Fig.2) e Penicillium roqueforti sui salami, tuttavia, ve ne sono alcune che potrebbero costituire un problema per la nostra salute, soprattutto in relazione al rilascio di micotossine.
Per questo motivo, è necessario eseguire alcune analisi, come il test di Howard, per garantire la qualità e la salubrità dei prodotti che ingeriamo.

Micelio di P. nalgiovense che ricopre completamente il budello dei salami
Figura 2 – Micelio di P. nalgiovense che ricopre completamente il budello dei salami. [Fonte: microbialfoods.org]

Principio del test di Howard

Il Test di Howard Lam, noto anche come “metodo di conta per scorrimento Howard“, è un test che permette di valutare la presenza o meno di ife fungine all’interno di prodotti alimentari a base di pomodoro (concentrato, polpa fine e cubettata, ketchup etc.), o di altri frutti, e di stimarne quindi la qualità microbiologica in relazione alle pratiche igieniche dell’azienda.
La camera di conta è composta da un vetrino copri-oggetto con maschera nera e incavi, detti “anelli di Newton” disposti 5 x 5 a formare un quadrato composto, in totale, da 25 anelli di osservazione (Fig.3).
Ogni anello di Newton è a sua volta costituito da una griglia di 6 quadratini che permettono di valutare la lunghezza dell’ifa osservata. Infatti, si dà positività ad un anello solo quando l’ifa osservata supera in lunghezza 1/6 del diametro dell’anello stesso, oppure, quando è la somma della lunghezza delle ife osservate a superarlo.

Vetrino porta-oggetto e vetrino copri-oggetto con camera di Conta Howard, composta da una griglia di 25 anelli di Newton disposti 5 x 5
Figura 3 – Vetrino porta-oggetto e vetrino copri-oggetto con camera di conta per il test di Howard, composta da una griglia di 25 anelli di Newton disposti 5 x 5. [Fonte: medicalexpo.it]

Materiale necessario

Per eseguire il test di Howard sono richiesti alcuni materiali/strumenti:

  • succo di frutta (es. passata di pomodoro);
  • rifrattometro per lettura brix;
  • microscopio ottico con ingrandimento 10x;
  • vetrino porta-oggetto;
  • vetrino copri-oggetto con camera di conta Howard con maschera nera e incavi 5×5;
  • ago manicato;
  • spatole;
  • becher;
  • acqua deionizzata.

Metodo

A seconda della natura del campione e del suo valore di brix (contenuto zuccherino), può essere necessario diluirlo con acqua deionizzata o meno.
Dopo aver ottenuto il campione ottimale per l’osservazione, è necessario prelevarne una goccia con l’ago manicato e stemperarla successivamente sul vetrino porta-oggetto evitando la formazione di bolle.
Si procede poi con il posizionamento del vetrino copri-oggetto con camera di conta, facendo attenzione che la gocciolina sottostante vada a ricoprire l’intera area di osservazione.
Successivamente il vetrino va collocato sull’alloggiamento del microscopio con ingrandimento 10x.
Il campione va osservato scorrendo da un anello di Newton all’altro sulla stessa fila, per poi procedere con la fila sottostante etc., annotandosi sempre in che anello sono state osservate ife fungine con lunghezza superiore ad 1/16 del diametro dell’anello stesso.
Solitamente, è buona norma fare tre vetrini per ogni campioni.

Risultati del test di Howard

Al termine del processo si otterrà quindi un numero di anelli positivi e che presentano ife fungine.
Questo numero va moltiplicato per quattro, per ottenere quindi una percentuale significativa di contaminazione del campione osservato.
Per fare un esempio: ho dato positività per cinque anelli di Newton sul totale di venti, quindi –> 5 x 4 = 20% di contaminazione del campione.


Le ife fungine appaiono come delle strutture filamentose, ramificate, traslucide e spesso segmentate, come visibile in Fig. 4-5-6:

Aspetto delle ife fungine al microscopio ottico, senza colorazione
Figura 4 – Aspetto delle ife fungine al microscopio ottico, senza colorazione. [Fonte: quizlet]
Morfologia dei funghi filamentosi al microscopio ottico
Figura 5 – Morfologia dei funghi filamentosi al microscopio ottico. [Fonte: microbiologiaitalia.it]
Ammasso di ife fungine al microscopio ottico
Figura 6 – Ammasso di ife fungine al microscopio ottico. [Fonte: blogspot.com]

Fonti

Crediti immagini
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Giulia Baldi

Biologa A iscritta all'albo professionale. Laureata in Scienze Biologiche e in Biologia Agro-Ambientale con tirocini in ambito clinico (laboratorio di microbiologia e virologia) e ambientale (laboratorio di ricerca in interazioni pianti-ambiente). Master di II livello in Sicurezza Alimentare e Sistemi di Gestione.

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