Principi di diagnosi di malattie infettive

Sviluppare una corretta diagnosi di malattia infettive può non essere facile: prima di avanzare un’ipotesi diagnostica, infatti, è necessaria un’attenta analisi dei dati clinici e una loro valutazione epidemiologica.
Per effettuare una giusta diagnosi, inoltre, è importante una buona collaborazione tra il medico e il microbiologo. Il medico deve individuare correttamente i campioni da analizzare e comunicare al laboratorio il microrganismo sospettato come responsabile dell’infezione. Al contempo, il microbiologo dovrà essere pronto ad esplorare altre possibilità suggerite dalla situazione clinica del paziente.
Gli approcci generali alla diagnosi di laboratorio possono variare a seconda dell’agente eziologico sospettato e al tipo di sintomatologia che provocano.

Prelievo campione

Come detto precedentemente, di essenziale importanza è la scelta del campione (Fig. 1) da analizzare in laboratorio per la diagnosi di una malattia infettiva. Qualora il campione non fosse rappresentativo dell’infezione, infatti, neanche il miglior microbiologo del mondo potrà rettificare rapidamente l’errore commesso. Un altro ostacolo può essere dato, inoltre, dalla difficoltà di discernere gli agenti eziologici dai microrganismi che normalmente fanno parte della flora commensale dell’ospite.

Campione per urinocoltura
Figura 1 – Campione per urinocoltura. [Fonte: gravidanzaonline.it]


Il campione può essere prelevato direttamente, ovvero raccolto da un sito (es. polmone) o fluido (es. liquido cerebrospinale) sterile del corpo. I metodi di prelievo possono essere diversi, dall’agoaspirato alla biopsia chirurgica.

Il prelievo del campione può anche essere indiretto, ovvero derivante da essudati infiammatori (es. espettorato) che, pur provenendo da siti sterili, attraversano zone popolate da flora commensale. In questo caso, è necessario considerare una loro possibile contaminazione.
I campioni indiretti sono più rapidi e facili da ottenere, tuttavia, è alto il rischio di cattiva interpretazione.

Il campione può anche essere prelevato da un sito normalmente colonizzato da flora commensale (es. colon, faringe, etc.). In questi casi è necessario fare esami che selettivamente identifichino i patogeni non appartenenti alla normale flora microbica dell’ospite (es. Salmonella, Shigella, etc.).
La selezione dei campioni per diagnosi di infezioni virali è decisamente più semplice, sono pochi (o addirittura assenti) i virus commensali del nostro corpo.

Raccolta e trasporto campione

Il tampone sterile (Fig. 2) è il metodo più rapido per la raccolta del campione. Tuttavia, bisogna fare attenzione che sia sufficientemente idratato: servono almeno 5-10 ml di essudato infiammatorio per poter condurre correttamente le analisi.
Il campione deve poi raggiungere tempestivamente il laboratorio; infatti, la vitalità microbica può essere compromessa nel caso in cui i campioni venissero processati troppo tardi. Inoltre, con il passare del tempo, la normale flora microbica del campione (es. feci con batteri enterici) può prendere il sopravvento sui patogeni da rilevare.
Per questi motivi, sono stati sviluppati numerosi terreni di coltura utili a garantire la sopravvivenza dei patogeni fino al laboratorio. Questi terreni combattono l’essiccamento, contengono nutrienti, presentano sistemi tamponanti e minimizzano lo sviluppo dei contaminanti.

Tampone sterile nasale per diagnosi malattia infettiva
Figura 2 – Tampone sterile nasale per diagnosi malattia infettiva. [Fonte: neosmed.it]

Esame diretto del campione

Per la diagnosi di malattie infettive è necessario identificare rapidamente gli agenti eziologici, però capita raramente che questi possano essere avvistati ad occhio nudo nel campione (es. grandi parassiti in campioni fecali). Per questo spesso si utilizza il microscopio ottico per analizzare strisci di sangue o sezioni istologiche adeguatamente colorate. Al microscopio possono essere visualizzati anche i batteri più piccoli (1-2 micron), tuttavia, sono necessarie delle adeguate colorazioni per poterli evidenziare.
Possono essere colorati con diverse metodiche che prevedono coloranti quali il cristalvioletto, il blu di metile, la carbofucsina e la safranina.
Le due colorazioni più frequentemente utilizzate sono la colorazione di Gram (Fig. 3) e la Ziehl-Neelsen, entrambe basate su una prima colorazione seguita da una decolorazione e da una colorazione finale di contrasto. La prima utile per evidenziare differenze di struttura legate al peptidoglicano, la seconda per evidenziare i batteri acido-resistenti.

Colorazione di Gram
Figura 3 – Colorazione di Gram. [Fonte: healthfixit.com]

Per quanto riguarda i miceti, alcuni sono decisamente grandi e visibili ad occhio nudo, mentre altri vengono semplicemente preparati a fresco su un vetrino senza particolare colorazione. I miceti presenti in campioni di espettorato o in altri fluidi biologici devono essere processati in idrossido di potassio e poi colorati con bianco di calcofluor o inchiostro di china.
Per i parassiti si ricercano le uova o le cisti, e le si contrasta con colorazione iodinata.

Le colture

Solitamente il metodo diagnostico più sfruttato per la diagnosi in vitro di malattie infettive è quello colturale. Va tuttavia specificato che, sebbene la maggior parte dei microrganismi sia in grado di crescere su diverse tipologie di terreni di coltura, ve ne sono alcuni che sono intracellulari obbligati (es. Chlamydia, Rickettsie).
Un singolo batterio, posto nelle ideali condizioni di crescita, può svilupparsi e moltiplicarsi fino a formare colonie visibili ad occhio nudo.
I terreni di coltura maggiormente utilizzati possono essere liquidi, ovvero “brodi”, derivati dalla digestione di proteine animali con aggiunta di nutrienti come glucosio, siero, sangue di pecora o di cavallo, estratto di lievito, etc. Dai terreni liquidi si possono ottenere quelli solidi tramite l’aggiunta di agenti gelificanti quali l’agar, polisaccaride inerte derivante da alghe marine. Nel terreno liquido i microrganismi creano torbidità e aggregati, misurabili grazie alla riflessione della luce. Al contrario, la semina microbica sui terreni solidi ne permette la distribuzione e l’ottenimento di colonie isolate. Quest’ultime possono differire per forma, dimensioni, morfologia, odore e colore (Fig. 4).

Colonie batteriche di Pseudomonas aeruginosa con caratteristica pigmentazione verde-azzurra dovuta al rilascio di pioverdina
Figura 4 – Colonie batteriche di Pseudomonas aeruginosa con caratteristica pigmentazione verde-azzurra dovuta al rilascio di pioverdina. [Fonte: biomedhs.com]

Terreni nutritivi

I microbiologi hanno sviluppato numerosi terreni di coltura adatti alle esigenze della maggior parte dei microrganismi coltivabili. Questi terreni sono quotidianamente utilizzati nei laboratori per la diagnosi di malattie infettive.
Vi sono numerosi terreni nutrizionali che favoriscono lo sviluppo delle principali categorie di microrganismi di interesse clinico. Contengono nutrienti derivanti dalla digestione enzimatica di muscoli, cervello, fagioli, latte, diverse tipologie di zuccheri semplici e amminoacidi, ma anche sangue e digesto pancreatico di caseina.

Terreni selettivi

Vi sono svariati terreni selettivi che vengono impieganti per campioni che derivano da zone colonizzate da un abbondante flora commensale che, crescendo, potrebbe mascherare la presenza dei patogeni. Per tale ragione i terreni selettivi includono dosi note di antibiotici, coloranti e additivi chimici, capaci di selezionare adeguatamente lo sviluppo microbico.

Terreni differenziali

Esistono anche i terreni differenziali che esaltano le caratteristiche biochimiche di alcuni gruppi microbici particolari. Possono contenere zuccheri e indicatori di pH (Fig. 5): quando lo zucchero viene fermentato, vengono liberati acidi che fanno virare il pH del terreno. Tra l’altro, l’aggiunta di sangue con globuli rossi permette di evidenziare il fenomeno di emolisi che consiste nella lisi parziale o totale delle emazie.

Agar Mcconkey, terreno differenziale con lattosio e rosso neutro. I batteri che fermentano il lattosio liberano acidi e formano colonie rossastre
Figura 5 – Agar MacConkey, terreno differenziale con lattosio e rosso neutro. I batteri che fermentano il lattosio liberano acidi e formano colonie rossastre. [Fonte: pinimg.com]

Condizioni atmosferiche

La maggior parte dei microrganismi cresce a temperature di incubazione comprese tra i 35 e i 37°C, si tratta principalmente di aerobi o anaerobi facoltativi che proliferano in presenza di ossigeno con un 2-5% di biossido di carbonio. Affinché si possa fare una corretta diagnosi di malattia infettiva, è necessario che i microrganismi sopravvivano fino al laboratorio. Per ottenere questa atmosfera, generalmente si utilizzano giare (Fig. 6) con candele che, bruciando, consumano ossigeno e liberano fino al 2% di anidride carbonica.
Alcuni batteri, come Campylobacter, sono microaerofili e richiedono una riduzione di ossigeno fino al 5%.
Altri ancora sono detti “anaerobi obbligati“, cioè microrganismi che muoiono immediatamente se posti a contatto con l’ossigeno. Per favorirne la crescita si prediligono perciò terreni con agenti riducenti come cisteina, tioglicolato e acido ascorbico.

Giara per atmosfera controllata
Figura 6 – Giara per atmosfera controllata. [Fonte: pinimg.com]

Identificazione dei microrganismi

Il riconoscimento di microrganismi coltivabili può essere ottenuta tramite l’allestimento di colture pure sulle quali si eseguono, generalmente, test e saggi biochimici per l’identificazione del gruppo tassonomico. Per esempio, le reazioni biochimiche (Fig. 7) dovute all’ossidazione di particolari substrati, se analizzate con tabelle e sistemi computerizzati, permettono di raggiungere un’identificazione microbica piuttosto precisa. Nel caso in cui si sospetta che l’agente eziologico possa produrre una determinata tossina, si procede con l’utilizzo di terreni neutralizzanti che ne permettono la successiva identificazione.

Test biochimico per l'identificazione di cellule di lievito
Figura 7 – Test biochimico per l’identificazione di cellule di lievito. [Fonte: constantcontact.com]

Isolamento ed identificazione virale

Le colture cellulari rappresentano il principale metodo di isolamento dei virus patogeni, in quanto ne consentono la crescita e la replicazione. Si realizzano a partire da frammenti tissutali o da tessuti trattati con agenti disgreganti come la tripsina, e le cellule ottenute vengono poste in coltura solida o liquida, in supporti di plastica o di metallo.
Esistono colture primarie derivate direttamente dalle cellule di un tessuto e dalle uguali caratteristiche, e colture secondarie derivate dalla propagazione di cellule già poste in coltura di cui ne mantengono abbastanza le caratteristiche.
L’ulteriore propagazione di cellule derivanti da una coltura secondaria può portare a due eventi: alla morte delle cellule, oppure allo sviluppo di nuove caratteristiche con acquisizione di tratti di “immortalità” (replicazione infinita).

La moltiplicazione virale nelle colture cellulare è osservabile tramite effetti citopatici o litici. Gli effetti citopatici si manifestano come cambiamenti morfologici: si passa da cellule allungate a tondeggianti, oppure da cellule singole a sincizi (es. virus del morbillo).
I virus emoagglutinanti possono essere rilevati tramite l’aggiunta di emoagglutinine alla coltura, esattamente come l’emoadsorbimento può essere evidenziato tramite l’aggiunta di globuli rossi.

L’isolamento e l’identificazione virale possono essere ottenuti tramite diverse modalità:

  • Neutralizzazione: si pone il virus a contatto con un substrato dotato del suo anticorpo specifico; questo provoca neutralizzazione del suo carattere infettivo.
  • Citologia e istologia: in alcuni casi la presenza del virus induce cambiamenti citologici nelle cellule, per esempio, l’Herpes simplex provoca la formazione di inclusioni citoplasmatiche neuronali note come “Corpi di Cowdry di tipo A” (Fig. 8).
  • Microscopia elettronica: l’immuno-elettro-microscopia permette la caratterizzazione mediante l’agglutinazione specifica di particelle virali in presenza del proprio antisiero.
Corpi di Cowdry di tipo A
Figura 8 – Corpi di Cowdry di tipo A in cellula neuronale. [Fonte: pinimg.com]

Sistemi immunologici

La diagnostica microbica spesso si basa sul legame antigene-anticorpo. Antisieri specifici possono essere usati per ricercare gli antigeni omologhi in coltura e, analogamente, antigeni specifici possono essere utilizzati per ricercare anticorpi ematici.
Quando un antigene solubile si coniuga nelle corrette condizioni con il suo anticorpo, forma un precipitato visibile e rilevabile tramite immunoelettroforesi. Il rilevamento di questo legame può essere amplificato tramite l’aggiunta di un marcatore fluorescente (immunofluorescenza), di un isotopo radioattivo (radioimmunologia) o di un enzima (dosaggio immunoenzimatico). La presenza e la quantificazione del legame antigene-anticorpo può perciò essere misurata tramite fluorescenza (Fig. 9), radioattività o reazione chimica con catalizzatore enzimatico.

Immagine ottenuta con tecnica immunofluorescente
Figura 9 – Immagine ottenuta con tecnica immunofluorescente. [Fonte: olympus-lifescience.com]

Analisi acidi nucleici

Il materiale genetico dei principali microorganismi umani è stato sequenziato e reso disponibile all’interno di banche dati. Queste ultime permettono quindi di avere un riscontro positivo qualora si avesse a disposizione un frammento di materiale genetico ignoto da identificare.
In aggiunta a ciò, la ricerca degli acidi nucleici permette di identificare tutti quei microorganismi che provocano infezioni ma che non sono coltivabili tramite metodi classici.

Tra i metodi analitici di questo tipo più sfruttati vi è certamente l’ibridazione con sonde (Fig. 10). Quando la doppia elica del DNA viene denaturata, i filamenti restano liberi e ibridabili con sonde complementari che sono costruite ad hoc per la ricerca di una specifica sequenza, e sono generalmente legate ad una molecola (es. fluorocromo) rintracciabile da un sistema rilevatore.
Spesso il materiale genetico utile per l’ibridazione viene precedentemente separato in un gel di agarosio, mediante una tecnica nota come “ibridazione Southern blot“.
Quando il DNA del campione non è sufficiente per l’identificazione, è comunque possibile amplificarlo tramite PCR (Reazioni a Catena della Polimerasi).

Ibridazione con sonde fluorescenti
Figura 10 – Ibridazione con sonde fluorescenti. [Fonte: couleur-capisco.com]

Emoculture

Quando gli agenti eziologici si diffondo nel torrente ematico, l’infezione diventa sistemica. In una situazione così, identificarli ed intervenire tempestivamente risulta essere di vitale importanza per salvare il paziente. Il campione ematico, innanzitutto, deve essere ottenuto in maniera sterile disinfettando la superficie cutanea con alcol e tintura di iodio. Per un paziente adulto servono almeno 20 ml di sangue, mentre per un bambino ne bastano da 1 a 5 ml.
I terreni di coltura più utilizzati per emocolture (Fig. 11) sono il TSB (Typtic Soy Broth) e il BHI (Brain Heart Infusion). Il campione va incubato a 37°C per 12-24 h in appositi strumenti che mantengono le boccette in agitazione.

Contenitori per emocolture
Figura 11- Contenitori per emocolture. [Fonte: microbiologia.eoc.ch]

Fonti

Crediti immagini

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