All’arrembaggio di un pathway di pirateria ematica in Acinetobacter baumannii

Acinetobacter baumannii è un coccobacillo Gram-negativo (Fig. 1), le cui caratteristiche biochimiche principali sono quelle di essere non fermentante, catalasi positivo, ossidasi negativo e strettamente aerobio. Batteri del genere Acinetobacter sono ubiquitari, ma gli isolati di specie A. baumannii sono quasi esclusivamente di origine ospedaliera. In questi ambienti A. baumannii può essere un patogeno opportunista e causare infezioni anche gravi in individui già immunocompromessi.

Acinetobacter: pagogeno ESKAPE

A. baumannii è responsabile di circa il 10% di tutte le infezioni nosocomiali, ed è stato incluso dalla WHO nella lista dei patogeni ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa ed Enterobacter spp). La problematica principale relativa a queste infezioni è l’elevato numero di isolati antibiotico-resistenti, caratteristica molto spiccata in questo patogeno. Le infezioni più gravi causate da A. baumannii provocano principalmente polmoniti e batteriemie in pazienti in terapia intensiva. In genere la terapia tradizionale contro l’infezione da A. baumanii è a base di carbapenemi, ma nei ceppi resistenti l’unica arma clinica a disposizione è la colistina.

Figura 1 - Immagini acquisite mediante microscopio elettronico a scansione di A.baumannii. (a) A.baumannii adeso a una cellula epiteliale alveolare umana. (b) A.baumannii adeso a ife di Candida albicans - Acinetobacter
Figura 1 – Immagini acquisite mediante microscopio elettronico a scansione di A.baumannii. (a) A.baumannii adeso a una cellula epiteliale alveolare umana. (b) A.baumannii adeso a ife di Candida albicans

Sistema di acquisizione del ferro in A. baumannii

In A. baumanii il ferro svolge un ruolo fondamentale in processi vitali come la replicazione del DNA e il metabolismo. La richiesta di ferro di A. baumannii è una potenziale debolezza che può essere sfruttata per interventi a scopo terapeutico. Nel contesto degli umani, l’eme è il più grande serbatoio di ferro, tuttavia, è in gran parte inaccessibile in quanto è strettamente legato a proteine ingombranti come l’emoglobina, la mioglobina e l’albumina. I patogeni Gram-negativi hanno adottato differenti strategie che coinvolgono macchinari proteici specializzati per il “bracconaggio” dell’eme da queste emoproteine, e per il trasporto dell’eme attraverso la membrana esterna batterica. I sistemi di assorbimento dell’eme si basano su proteine a beta-barilotto chiamate recettori della membrana esterna TonB-dipendenti (TBDR); queste riescono a rubare e trasportare l’eme attraverso la membrana. Inoltre, delle proteine accessorie chiamate emofori hanno alta affinità per l’eme e ne facilitano l’assorbimento.

Geni per l’utilizzo del ferro

Numerose annotazioni bioinformatiche hanno identificato due potenziali geni cluster (rappresentati in figura 2) coinvolti nell’utilizzo dell’eme:

  • Il primo è presente in tutti i ceppi di A. baumannii e codifica un TBDR;
  • Il secondo cluster predetto per l’assorbimento dell’eme è chiamato hemO ed è necessario per garantire la degradazione dell’eme mediante l’eme ossigenasi.
organizzazione genica funzionale alla captazione di Ferro - Acinetobacter
Figura 2 – Rappresentazione grafica dei due loci presenti nel genoma di A.baumannii preposti all’assorbimento di ferro

Il cluster hemO contiene un gene (arancione) che codifica un TBDR unico denominato recettore dell’emofilina o HphR. Un gene vicino (azzurro), era precedentemente annotato come codificante una proteina TonB, ed è omologa a un modulatore di assemblaggio delle lipoproteine di superficie o Slam. Nello stesso cluster è stato trovato anche HphA (rosa).

HphA: un emoforo secreto da una proteina Slam

Si è ipotizzato che la proteina HphA sia una lipoproteina coinvolta nell’assorbimento dell’eme e che dipenda da Slam per la secrezione e localizzazione nella superficie cellulare. Ciò era plausibile poiché HphA contiene un motivo di lipidazione che si trova nelle lipoproteine di superficie e gli Slam si trovano frequentemente adiacenti ai substrati che traslocano. Per studiare ulteriormente la natura degli Slam, i tipi di substrati che traslocano e far luce su un potenziale nuovo meccanismo di assorbimento dell’eme, è necessario caratterizzare ulteriormente questa coppia Slam-HphA.

Il primo passo naturale verso la comprensione della funzione di HphA è stato quello di esprimere, purificare e cristallizzare la proteina. Fortunatamente, HphA si esprime bene in Escherichia coli ed era semplice da purificare. Come mostrato in figura 3, la proteina appare di colore rosso intenso, riflesso nei bellissimi cristalli a bastoncino. Il colore rosso è indicativo dell’eme legato. Una volta raccolti i dati di diffrazione dei raggi X, è apparso evidente che l’eme era infatti legato ad HphA attraverso due residui di istidina trovati in un dominio clamp-like. In definitiva si è scoperto che HphA adotta una struttura notevolmente simile alle lipoproteine di superficie dipendenti da Slam, e lega l’eme fungendo da emoforo.

organizzazione spaziale di HphA - Acinetobacter
Figura 3 – (a) Cristalli e (b) struttura ai raggi-X di HphA, dove l’eme è rappresentata con struttura bastoncellare grigia, e il ferro in arancione

Ruolo funzionale di HphA in A. baumannii

Investigando sull’esposizione in membrana di HphA dipendente da Slam, sono stati raccolti dati contrastanti: alcuni saggi confermavano la dipendenza da Slam per la localizzazione in membrana, mentre in altri saggi risultava evidente che HphA non era ancorata alla membrana, bensì secreta nel medium di coltura. Successivamente è stato chiarito che Slam è necessario per la secrezione di HphA nell’ambiente.

In definitiva l’HphA secreta agisce come un emoforo, in grado di legarsi e rimuovere passivamente l’eme dal più grande serbatoio di eme nell’uomo: l’emoglobina.

Oltre al lavoro sulle proteine, è stata studiata l’importanza biologica del cluster del gene Slam per la crescita e la virulenza di A. baumannii. Questi strumenti sono stati fondamentali per stabilire che il cluster di geni Slam è essenziale per la crescita batterica con emoproteine umane come uniche fonti di ferro/eme. Un’altra importante scoperta è stata che una proteina della membrana esterna nel cluster del gene Slam, denominata HphR, funge da recettore per HphA, poiché l’eme deve essere rilasciato dall’emoforo e trasferito a un canale per l’ingresso nella cellula.

Rappresentazione delle molecole coinvolte all'utilizzo di Ferro in A. baumannii - Acinetobacter
Figura 4 – Rappresentazione grafica dei meccanismi molecolari coinvolti nell’assorbimento diretto e a due componenti dell’eme in A.baumannii

Implicazioni terapeutiche

Sebbene A. baumannii possa acquisire ferro da diverse fonti, l’eme gioca un ruolo centrale nella virulenza. Non è chiaro perché A. baumannii possieda due gruppi di captazione dell’eme. Esaminare i sistemi di acquisizione dell’eme in altri organismi fornisce alcune prospettive: i due batteri Gram-negativi Serratia marcescens e Pseudomonas aeruginosa codificano per due recettori dell’eme utilizzati a seconda delle concentrazioni di questo nell’ambiente. Sistemi multipli di acquisizione dell’eme in A. baumannii possono consentirgli di utilizzare una gamma più ampia di concentrazioni di eme nell’ospite e ottimizzare l’espressione genica.

Patogenesi di A. baumannii

Nella patogenesi di A. baumannii, durante la colonizzazione iniziale della mucosa nasale, la concentrazione di eme è limitata, al contrario dell’ambiente vasale dove è presente in maggiori concentrazioni. I meccanismi dell’assorbimento di eme in A. baumannii rappresentano un argomento ad oggi poco approfondito in letteratura scientifica, ma potrebbero essere sfruttati in futuro per progettare strategie per prevenire o curare l’infezione di A. baumannii tramite antibiotici o vaccini specifici.

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Damiano Squitieri

Sono Damiano Squitieri, laureato magistrale in Biotecnologie per la medicina personalizzata. La mia esperienza di laboratorio si concentra su ricerca e sviluppo in microbiologia, con un focus particolare per l'utilizzo di nanomateriali per prevenire l'adesione di biofilm su dispositivi medici.

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