Il meccanismo dell’RNAi per avere piante transgeniche resistenti al virus del mosaico giallo del grano (MYMV)

Il virus del mosaico giallo del grano (WYMV), è veicolato da  Polymyxa graminis, un simil fungo, difficile da eliminare con fungicidi convenzionali. Per sopperire a questa problematica, si può ottenere grano ad alta resa per mezzo dell’RNAi.

La malattia del mosaico giallo del grano è caratterizzata da foglie a mosaico o a strisce gialle e da un arresto della crescita della pianta, ed è una delle principali minacce alla produzione, provocando una riduzione della resa dal 20 al 70%, con conseguenti danni al settore.

Analisi genetiche, riportano che la resistenza del grano al virus (WTMV)  è controllata da uno a tre geni, con un gene principale associato al cromosoma omologo del gruppo 2. Quindi l’ingegneria genetica può essere una buona strada per avere piante più resistenti.

Obbiettivo dell’uso dell’RNAi per ottenere grano ad alta resa

In questa guida si analizzano i risultati delle ricerche ottenute, per avere cultivar resistenti a WYMV. In seguito all’inserimento del gene antisenso NIb8 (la replicasi NIb di WYMV) e una barra genica selezionabile, il grano ha avuto un aumento della resa del 10%. Quindi si ha grano ad alta resa per mezzo dell’RNAi.

Meccanismi molecolari alla base del trattamento

La resistenza è quindi conferita inserendo i genomi virali in quello delle piante, che esprimeranno proteine eterologhe o sequenze di RNA virali, diventando resistenti.

Questo succede, attraverso il silenziamento dell’RNA detto anche interferenza dell’RNA (RNAi), che è uno dei principali meccanismi di resistenza mediata dall’RNA nelle piante transgeniche che trasportano la sequenza virale.

Dato che si inseriscono geni virali in orientamento positivo ed inverso, come lunghe e brevi sequenze di dsDNA a forcina e inducendo microRNA artificiali, si arriva al blocco dei geni virali.

Dalle osservazioni fatte nello studio, si è visto che i costrutti transgenici in grado di formare alti livelli di trascritti di dsRNA (RNA a doppio filamento) sono più efficaci nel produrre piante resistenti ai virus rispetto ai costrutti che producono solo RNA senso o antisenso. 

Il silenziamento dell’RNA è un processo evolutivamente conservato in un’ampia varietà di organismi eucarioti.

Tale fenomeno, è avviato quando i dsRNA sono elaborati da un enzima simile alla ribonucleasi III, chiamato Dicer, in piccoli RNA interferenti (siRNA) da 21 a 24 nucleotidi. 

Gli siRNA sono quindi incorporati in un complesso di silenziamento indotto dall’RNA per guidare la degradazione o la repressione traslazionale di bersagli di RNA omologhi in un modo sequenza-specifico, così da bloccare i geni virali impedendone l’infezione.

Costrutto, vettore e tecniche per il loro ottenimento

  1. Genoma del virus del mosaico giallo del grano (RNA1), con la varie proteine che esso esprime.
  2. Struttura del vettore pUbi-NIb. NIb8, sequenza inversa del complemento del gene NIb polimerasi (regione 5284-6495 bp); 35S poliA, terminatore. Si osservano 2 siti di taglio uno per EcoR1 e l’altro per SsP.
  3. Diagramma del vettore pAHC20 contenente il gene bar per la selezione delle piante negli esperimenti  di co-trasformazione; bar, gene resistente agli erbicidi; N. 3′, Terminatore.
Figura 1 - Rappresentazione del costrutto e del vettore per avere grano ad alta resa per mezzo dell' RNAi [Fonte: Minng Chen, Et al., 2013]
Figura 1 – Rappresentazione del costrutto e del vettore per avere grano ad alta resa per mezzo dell’ RNAi [Fonte: Minng Chen, Et al., 2013]

In seguito ad amplificazione e purificazione del gene NIb di WYMV, mediante RT-PCR, si è identificata la regione codificante NIb della poliproteina RNA1 (nts 4912-6495). 

Dall’analisi del sequenziamento si evince che è omologa alle sequenze nucleotidiche del gene NIb (5284-6495). 

Parte del gene NIb (NIb8), è stata amplificata dal genoma del virus utilizzando 3 primer linker Bam HI NIb8F e NIb8R.

In seguito a ligazione di NIb8 al vettore lineare pUbi-35S, sono stati ottenuti costrutti con il frammento NIb8 inserito in entrambe le direzioni sotto il controllo del promotore dell’ubiquitina. 

Il costrutto contenente il frammento dell’inserto NIb8 inverso è stato quindi identificato mediante sequenziamento e pubi-NIb. Il plasmide helper pAHC20 con il gene del marcatore selettivo (resistenza agli erbicidi) è preparato per la co-trasformazione con il plasmide pubi-NIb.

Trasformazione e procedura di selezione dei trasformanti

La tecnica usata è il metodo biolistico. Gli embrioni immaturi di cv. Yangmai 158, sono stati fatti passare per lo stato di callo ed in seguito a pretrattamento con una soluzione ad alta osmosi (terreno SD2 integrato con 0,2 mol di mannitolo e 0,2 mol di sorbitolo) subendo un bombardamento con tecnica PDS-100/He (Bio-Rad, Hercules, CA), con una membrana da 1100 psi e particelle d’oro rivestite con DNA plasmidici.

La conferma dell’avvenuta inserzione del plasmide all’interno della pianta è verificata tramite:

  • PCR
  • Irrorazione con erbicida (Liberty, 150 ppm o Basta, 100 ppm)

Risultati degli esperimenti per avere grano ad alta resa per mezzo dell’RNAi

In seguito a trasformazione, differenziamento nel callo e successiva crescita su terreno selettivo, i risultati ottenuti sono stati visualizzati grazie ad tecniche come la PCR, Southern blot e Western blot previa digestione con EcoR1. Le analisi hanno confermato che nelle piante transgeniche la resistenza al virus del mosaico giallo del grano (WYMV), è data dal gene Nib8.

Si è anche dimostrato mediante analisi alla PCR che il gene Nib8 antisenso, si mantiene stabile nelle generazioni.

Nib8 offre anche una media copertura anche a le infezioni di altri Virus (virus del mosaico del grano cinese).

Gli siRNA sono rilevati anche attraverso il sequenziamento profondo con tecnica Illumina, che ha permesso di confrontare (tramite programmi bioinformatici) le sequenze di c-DNA di librerie inerenti ai genomi delle specie resistenti insieme a quelli virali.

Conclusioni

Un importante considerazione da fare, è che il grano presenta la resistenza a WYMV soprattutto in serra. In campo gli esperimenti di trasformazione, tendono a essere in contrasto con quelli osservati in condizioni controllate. C’è da dire però che in tale studio, la resistenza al virus è stata indentificata per 5 anni consecutivi in 3 diversi siti, quindi si può ritenere che il frumento transgenico descritto sia il primo con una resistenza duratura nel tempo.

Fonti

  • Minng Chen, Et al, Durable field resistance to wheat yellow mosaic virus in transgenic wheat containing the antisense virus polymerase gene. Plant Biotechnology Jurnal (2013)
  • 50 Grandi Idee Biotecnologie -Stefano Bertacchi- (Edizione Dedalo)

Immagini

Foto dell'autore

Giampiero Federici

Attuale studente di biotecnologie, presso il dipartimento di: Scienze Chimiche, della Vita e della Sostenibilità Ambientale (Università degli studi di Parma)

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