La prima parte di questo articolo, pubblicata in data 11 Dicembre, è consultabile al link:
Rivitalizzazione dei microrganismi da collezioni
Vediamo ora come utilizzare i microrganismi da collezioni.
Generalmente, i microrganismi acquistati da una collezione sono forniti con un certificato che riporta nel dettaglio informazioni quali i risultati dei test d’identificazione ed il titolo della coltura, nonché le caratteristiche ed i requisiti del ceppo stesso.
Abbinato a questo certificato, possono esserci anche anche le metodiche raccomandate per la rivitalizzazione e la crescita, soprattutto se la specie possiede esigenze specifiche.
Nel caso in cui ciò non avvenisse, la prassi corrente (consigliata anche dalla Farmacopea) prevede tuttavia la realizzazione di una brodo coltura di lavoro primaria, attraverso la semina in terreno liquido di tipo “TSB+Ye” (Tryptone Soy Broth with Yeast extract), indipendentemente dal fatto che il ceppo provenga da Cryobank piuttosto che sia stato conservato liofilizzato.
Nel primo caso (ceppo da Cryobank) occorre però distinguere tra i microrganismi conservati con la tecnica “Protect Technology” dagli altri (Fig.1).
La Protect Technology permette infatti di prelevare le sfere titolate dalla vial secondo le esigenze e di procedere quindi direttamente alla semina, senza necessità di effettuare uno scongelamento preliminare a temperatura ambiente: cosa che invece è necessario fare se il ceppo è stato conservato con altre tecniche.
Data la sua particolare natura, per completezza va detto che la Protect Technology permette anche di evitare la brodocoltura e volendo, di seminare direttamente in piastra agarizzata una o più sferette (il terreno utilizzato sarà comunque sempre un terreno di tipo TSB: a questo proposito, rinviamo al nostro articolo.
Dopo la semina, la brodo coltura (se si è utilizzato questo metodo) viene generalmente incubata per 24-48 ore alla temperatura ottimale per la specie microbica, quindi è testata per verificarne ulteriormente la purezza attraverso vari metodi che possono spaziare da quelli torbidometrici (spettrofotometria) a quelli colorimetrici (ad esempio con colorazione di Gram), oppure ancora biochimici.
Soltanto al termine di queste verifiche la coltura di lavoro primaria potrà essere considerata realmente pronta per l’utilizzo.
Indipendentemente dal ceppo scelto infatti, quando si lavora con microrganismi provenienti da collezioni occorre tenere sempre conto di tre fattori: l’origine del ceppo, la conservazione ed infine (ultimo ma non meno importante) il numero di passaggi dalla coltura di riferimento.
Origine del ceppo
La tracciabilità completa del microrganismo, la sua intera filiera, dev’essere assicurata tanto dai produttori quanto dai distributori: ciò si rivela semplice laddove essi siano in possesso della ATCC Licensed Derivative®, cui abbiamo fatto menzione precedentemente, che è garanzia di origine e filiera distributiva controllata.
L’utilizzo di ceppi provenienti da collezioni in possesso di tale licenza, tutela infatti maggiormente quanto a caratteristiche qualitative come purezza e performance degli stessi, oltre ad avere il vantaggio di fornire microrganismi già titolati e disponibili in una forma subito pronta all’uso.
Conservazione
Per conservazione, in questa sede s’intende come conservare le colture generate a partire da un ceppo proveniente da una collezione microbica.
Alcuni laboratori infatti preferiscono creare una propria ceppoteca interna generandola da una coltura pura standardizzata, attraverso una serie di subcolture che devono tuttavia rispettare la “Regola dei cinque passaggi” (sulla quale torneremo nel prossimo paragrafo).
Per conservare tali subcolture, si può scegliere indifferentemente se ricorrere alla crioconservazione oppure alla liofilizzazione, attuandole con le modalità già descritte.
L’obiettivo principale consisterà comunque sempre nel mantenere la vitalità e la stabilità genetica della coltura, rallentandone il metabolismo ed estendendo cosi’ il periodo di durata previsto.
I metodi principali per ottenere tale scopo sono principalmente quattro:
- eseguire subcolture regolari su terreni freschi dei ceppi conservati nel proprio laboratorio;
- stoccare i ceppi su slant agar a temperatura di 4 °C per brevi periodi;
- conservare le cryovials in freezer o in azoto liquido (con aggiunta di glicerolo o DMSO);
- liofilizzare la coltura in ampolle per stoccaggio a lungo termine.
In quest’ultimo caso, i ceppi microbici liofilizzati verranno di solito conservati ad una temperatura tra i 2 e gli 8 °C .
Numero di passaggi
Un “passaggio” può essere definito come il trasferimento del microrganismo da una coltura vitale ad un terreno fresco sul quale possa crescere.
Ogni subcoltura cosi’ ottenuta costituisce pertanto un passaggio.
La produzione di colture stock (o di lavoro) a partire da una coltura pura ATCC® rappresenta i primo passaggio, mentre al contrario la reidratazione di un ceppo liofilizzato, oppure lo scongelamento di un ceppo mantenuta in congelatore non lo sono: lo diventano, solo se il microrganismo cosi’ ottenuto viene riseminato in terreno fresco.
Il principio base da seguire è sempre quello tuttavia dei cosiddetti 5 passaggi, secondo il quale una coltura che si voglia utilizzare per qualsivoglia scopo, non deve mai provenire da un’altra subcultura che sia stata ottenuta da una serie di più di cinque passaggi.
Questo principio è indispensabile per garantire tanto la vitalità, quanto la stabilità genetica e le caratteristiche del ceppo.
Anche per la stessa creazione delle ceppoteche, siano o meno interne, è opportuno pertanto l’uso di ceppi con un basso numero di passaggi.
Tipicamente comunque le norme delle Farmacopee disciplinano anche questo aspetto, indicando il numero di passaggi ammessi in base ai vari utilizzi possibili (ed alla provenienza) delle colture.
Sitografia di riferimento
- http://www.kairosafe.it/img/cms/Guide/Ceppi-e-Protect_1.pd
- fhttps://docplayer.it/56837017-Crioconservazione-dei-microrganismi-sistema-protect.html
Crediti per le immagini
Immagine in evidenza:
Figura 1:
