Colorazione Calcofluor White

Obiettivo della colorazione

Il “Calcofluor White” (Fig.1), noto anche come “bianco calcofluoro“, è un colorante chemifluorescente blu capace di legarsi in maniera non specifica ai polisaccaridi chitina e cellulosa della parete fungina, vegetale e algale.
Questo colorante serve quindi per:

colorare alcuni elementi fungini e parassitari;
osservare questi elementi tramite microscopia a fluorescenza.

**Figura 1** – Struttura chimica del colorante bianco calcofluoro. [Fonte: chemsrc.com]

In ambito clinico la colorazione viene utilizzata per determinare quale o quali specie siano responsabili dell’infezione e, conseguenzialmente, sviluppare una terapia efficacie.
I campioni analizzabili dipendono dalla possibile sede di infezione: possono essere campioni derivanti dalla cute, da unghie e capelli, tamponi vaginali, sangue e tessuti bioptici.
Solitamente i funghi, siano essi muffe o lieviti, sono patogeni opportunisti capaci di provocare danni alla salute di pazienti immunodepressi o deperiti. Tuttavia, in alcuni casi possono essere patogeni obbligati capaci di attaccare anche soggetti perfettamente sani provocando infezioni superficiali (es. cutanee) o addirittura sistemiche (disseminate).

Tra le infezioni micotiche più comuni vi sono certamente quelle cutanee con comparsa di chiazze rosse e squamose (es. tigne) e quelle localizzate nella cavità orale e vaginale (es. mughetto).

Il colorante viene utilizzato soprattutto per:

dimostrare la presenza di parassiti (es. amebe) individuandone le cisti.
Evidenziare le cicatrici (bud scars) delle cellule di lievito (Fig.2) per quantificarne l’età.
Può essere sfruttato per intensificare la colorazione Papanicolaou.
Per evidenziare le cisti di Pneumocystis, microsporidia e Cryptosporidium.
Per rilevare la presenza di Candida spp (Fig.3) in lesioni cancerose o pre-cancerose.

**Figura 2** – Cellule di lievito colorate con Calcofluor white. [Fonte: *biotium.com*]

**Figura 3** – C. albicans in bianco calcofluoro al microscopio a fluorescenza. [Fonte: ResearchGate]

Descrizione

Tra i test più rapidi che si possono fare per identificare e visualizzare strutture fungine vi è l’osservazione al microscopio di campioni colorati in fluorescenza con il Calcofluor White.
Il campione generalmente deriva da un raschiamento cutaneo, da un frammento di capelli/unghie, da tamponi vaginali, fluidi corporei ed espettorato.
Su questi, il colorante è in grado di legare saldamente le strutture fungine (Fig. 4) presenti e, se colpito da una luce con idonea lunghezza d’onda, permette di visualizzarle chiaramente al microscopio a fluorescenza.

**Figura 4** – Conidi fungini al microscopio ottico (in grigio-marrone) e al microscopio a fluorescenza a seguito della colorazione (in blu). [Fonte: ResearchGate]

Il Calcofluor White è un fluorocromo non specifico capace di legarsi alla chitina della parete fungina permettendo di rilevare rapidamente la presenza di funghi e lieviti di notevole importanza clinica come: Pneumocystis carinii, Microsporidium, Acanthamoeba, Naegleria, e Balamuthia.
Può essere ancora più performante se il campione viene trattato con una soluzione di idrossido di potassio (KHO) che dissolve gli elementi micotici.

Materiale occorrente

Calcofluor White;
Idrossido di potassio 10%;
Vetrino;
Carta assorbente;
Microscopio a fluorescenza.

Procedimento

Per colorare un campione con Calcofluor White è necessario seguire questi passaggi:

Posizionare con cura il campione su un vetrino pulito.
Aggiungere una goccia di colorante e successivamente una goccia di idrossido di potassio al 10%.
Lasciar riposare il campione per un minuto in modo tale che il colorante venga assorbito.
Rimuovere l’eccesso di colorante premendo delicatamente sul campione un pezzo di carta assorbente.
Osservare il campione sotto luce ultravioletta a 100-400x.

Osservazione

Gli elementi fungini, parassitari, e le cisti appaiono blu-verdi (Fig.5) se osservate sotto una fonte di raggi UV o una luce blu/viola.
Il colorante in soluzione acquosa assorbe a lunghezze d’onda compresa tra 300 e 412 nm con picco d’assorbimento a 347 nm.
La massima eccitazione del fluorocromo si ha sfruttando la luce ultravioletta anche se, come detto pocanzi, anche le fonti di luce blu/viola danno ottimi risultati.
Il tessuto sottostante può creare una fluorescenza di background gialla verde, tuttavia, gli elementi fungini/parassitari colorati appaiono molto più intensi e visibili.

**Figura 5** – Ife fungine che appaiono blu al microscopio a fluorescenza dopo essere state colorate. [Fonte: Slideshare]

Il risultato della colorazione può essere osservato nel Vid.1 sottostante:

Video 1 – Rotifero sottoposto a colorazione con Calcofluor white. [Fonte: Calcofluor staining of Rotifer trophi].

Limitazioni

Tra le principali limitazioni del Calcofluor White vi è il costo elevato e il fatto che può non essere particolarmente accurato in certi casi.
Tuttavia, esistono anche alcuni vantaggi: è veloce da utilizzare e permette diagnosi cito- e isto-patologiche, inoltre, non richiede tipologie particolari di reagenti per funzionare.