L’immunofluorescenza tra le moderne tecniche diagnostiche

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Cos’è l’immunofluorescenza

L’immunofluorescenza, nota anche con la sigla IF, è un’importante tecnica immunologica che consente il rilevamento e la localizzazione di un’ampia varietà di antigeni in un dato tessuto o tipo di cellula. Nel 1941 Coons et al. introdussero questa tecnica basata sul legame chimico tra un fluorocromo e un anticorpo. Data questa proprietà, è comunemente utilizzata nella pratica clinica e nelle applicazioni di ricerca per determinare otticamente l’espressione proteica e la localizzazione cellulare e intracellulare delle stesse proteine.

Con l’immunofluorescenza, partendo da una sezione di tessuto o da cellule opportunamente preparate, si realizza una reazione immunitaria antigene-anticorpo che può essere considerata come immonofluorescenza diretta, se vengono impiegati anticorpi direttamente coniugati a molecole fuorescenti, oppure può essere considerata immunofluorescenza indiretta, nel caso in cui la reazione antigene-anticorpo viene evidenziata utilizzando un secondo anticorpo, coniugato ad un fluorocromo, specifico per il primo. In questo modo si otterrà un campione “colorato” che sarà poi analizzato mediante microscopio a fluorescenza o microscopio confocale. Di conseguenza, la positività del test è riconducibile all’intensità della colorazione.

Perché eseguire il test

L’immunofluorescenza è una delle tecniche immunologiche più utilizzate in microbiologia, e più in generale in un laboratorio biomedico. Poter individuare specifici antigeni e anticorpi di varia natura presenti in un campione permette un ampio utilizzo di questa tecnica. In particolare, l’immunofluorescenza è utilizzata per cercare e identificare anticorpi sierici, in questo caso si fa riferimento all’immunofluorescenza indiretta, o depositi di antigeni e anticorpi caratteristici di una malattia parlando, dunque, di immunofluorescenza diretta in un prelievo umorale (ad esempio sangue e liquor cerebrospinale) o tissutale.

Alcuni esempi di malattie che possono essere diagnosticate tramite l’immunofluorescenza sono:

  • Lupus;
  • Sclerodermia;
  • Artrite reumatoide;

Gli esempi riportati appartengono ad una particolare classe di patologie, definite come autoimmuni.

Procedimento

Come già parzialmente descritto, l’immunofluorescenza è una tecnica di indagine effettuata mediante l’utilizzo di anticorpi diretti contro antigeni specifici di cui noi vogliamo ricercarne la presenza, marcati con una sostanza fluorescente nota come fluorocromo.

Quest’ultimo, qualora colpito da un fascio di luce, ha la capacità di emettere luce ad una lunghezza d’onda maggiore rispetto a quella assorbita. Grazie a questa caratteristica, è possibile rendere visibili gli eventuali immunocomplessi antigene-anticorpo che si sono venuti a formare. Due esempi di fluorocromi utilizzati sono l’isotiocianato di fluoresceina (FITC) e l’isotiocianato di tetrametilrodamina (TRITC). La fluorescenza del preparato è diversa a seconda del tipo di fluorocromo utilizzato: al microscopio a fluorescenza si osserverà un’emissione giallo-verde qualora venga utilizzato FITC, mentre la fluorescenza sarà arancio-rossa quando verrà utilizzato TRITC.

Generalmente, la metodica dell’immunofluorescenza prevede l’utilizzo di un reagente di laboratorio contenente un anticorpo in grado di fissarsi in modo specifico sulla sostanza cercata. Quest’ultimo, una volta combinato al colorante fluorescente (o marcatore), rende visibile la sostanza cercata sotto la luce ultravioletta. Se, dopo opportuno lavaggio del vetrino, il campione prelevato non contiene l’antigene non si osserverà nessun tipo di reazione. In caso contrario, invece, si potrà osservare la fluorescenza con forma e localizzazione che dipenderanno dalla struttura dell’antigene rilevato.

Attualmente, la tecnica di immunofluorescenza può avvenire secondo due modalità differenti, una diretta e l’altra indiretta.

Immunofluorescenza diretta

Nel metodo diretto (o primario), l’etichetta del fluoroforo viene coniugata direttamente all’anticorpo primario che reagirà con l’epitopo bersaglio. La tecnica di immunofluorescenza diretta è utilizzata principalmente per la ricerca di un antigene ignoto (ad esempio di un batterio) il quale, dopo essere stato fissato al vetrino o pozzetto attraverso specifiche metodiche, viene messo a contatto con i presunti anticorpi specifici. A questo punto lasciamo a contatto, per il tempo necessario, l’antigene con l’anticorpo in modo tale da avere un’interazione tra le due molecole che porterà alla formazione di un immunocomplesso. Successivamente, è opportuno lavare accuratamente il vetrino in modo da eliminare gli eventuali antigeni che non si sono legati.

Alla fine, analizzeremo il tessuto attraverso un microscopio a fluorescenza e se notiamo la presenza di corpuscoli brillanti significa che il siero contenente gli anticorpi fluorescenti è specifico per quell’antigene. In questo caso, quindi, siamo in presenza di un risultato positivo.

immunofluorescenza diretta
Figura 1 – Immunofluorescenza diretta [ncbi.nlm.nih.gov]

Immunofluorescenza indiretta

Il metodo indiretto prevede un processo di incubazione in due fasi:

  • Un anticorpo primario si lega all’epitopo target;
  • Un anticorpo secondario, marcato con fluoroforo, riconosce e si lega all’anticorpo primario;

Nell’immunofluorescenza indiretta il siero del paziente viene opportunamente diluito (passaggio fondamentale per ottenere la massima specificità del test senza diminuirne la sensibilità) e fatto reagire con il substrato specifico fissato nel pozzetto per ricercare gli autoanticorpi specifici. La scelta del substrato adeso al vetrino può essere rappresentata da cellule o sezioni di tessuto e determinerà la tipologia di anticorpo da rilevare. Se all’interno del siero sono presenti autoanticorpi, questi riconosceranno gli antigeni portando alla formazione di un immunocomplesso primario. Dopo questa prima fase di incubazione, in seguito ad opportuni lavaggi, si può procedere con una reazione secondaria tra il complesso ottenuto e un anticorpo marcato con fluorocromo (anticorpo secondario). A questo punto, se sarà possibile rilevare fluorescenza, vorrà dire che l’anticorpo ricercato è specifico per l’antigene a noi noto.

immunofluorescenza indiretta
Figura 2 – Immunofluorescenza indiretta [ncbi.nlm.nih.gov]

Vantaggi e svantaggi dell’immunofluorescenza

La tecnica di immunofluorescenza presenta diversi vantaggi e svantaggi. Tra i vantaggi:

  • Buona sensibilità e specificità di reazione;
  • Tecnica semplice e facile identificazione di elementi anche molto piccoli;
  • Il risultato è visualizzabile subito dopo la reazione immunologica;
  • Permette di indagare contemporaneamente la presenza di autoanticorpi rivolti contro diversi tipi di antigeni;
  • Ha un costo contenuto;

Tra gli svantaggi:

  • La fluorescenza decade rapidamente;
  • Strutture tissutali difficilmente identificabili;
  • A seconda dell’utilizzo di microscopi confocali o a fluorescenza, devono essere selezionati fluorofori che possono essere effettivamente eccitati e rilevati dall’attrezzatura disponibile;

Esempi di risultati che si possono ottenere con l’immunofluorescenza

L’imaging è un potente approccio per studiare l’espressione delle proteine ​​e ha il vantaggio, rispetto ad altre metodologie, di fornire informazioni spaziali in situ a livello di singola cellula. Utilizzando l’immunofluorescenza, è possibile ottenere informazioni dettagliate sulla distribuzione subcellulare delle proteine. Di seguito riportiamo alcuni esempi:

Immunofluorescenza di cellule di Schwann
Figura 3 – Cellule di Schwann in coltura colorate con una proteina fluorescente che permette il riconoscimento del citoscheletro. In dettaglio, la marcatura è stata realizzata utilizzando la Falloidina coniugata ad un fluoroforo [foto del dott. Samuele Negro]
Immunofluorescenza ottenuta da una sezione trasversale di nervo sciatico
Figura 4 – Sezione trasversale di nervo sciatico. In blu sono colorati i neuroni, in giallo le cellule di Schwann che avvolgono i neuroni stessi, isolandoli dall’ambiente circostante e favorendo la velocità di conduzione dell’impulso nervoso [foto del dott. Samuele Negro]
Immunofluorescenza dei neuroni del cervelletto
Figura 5 – Neuroni di cervelletto in coltura in cui è stata colorata una proteina del citoscheletro. Nel dettaglio è stato utilizzato un anticorpo specifico per la beta3-tubulina [foto del dott. Samuele Negro]

Fonti

Fonti immagini

Si ringrazia per la gentile concessione della Fig.3, della Fig.4 e della Fig.5 il dott. Samuele Negro, PhD

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