StrepB Agar

Principio

Lo StepB agar (Fig.1) è un terreno cromogeno per il differenziamento e l’isolamento degli streptococchi di gruppo B tra cui, molto noto, Streptococcus agalactiae.
Quest’ultimo, infatti, è causa di severe infezioni neonatali che interessano i bambini nelle prime tre settimane di vita (periodo estremamente delicato).
Siccome diversi studi dell’OMS (Organizzazione Mondiale della Sanità) mostrano che il 12-27% delle donne incita è interessato dal patogeno, diventa di sempre più vitale importanza rilevarne la presenza entro le 34-38 settimane di gestazione.
Per queste ragioni, il terreno di coltura StrepB risulta essere particolarmente indicato nella fase di screening preventivo.

StrepB agar con colonie fucsia di streptococchi di gruppo B (es. S. agalactiae) e colonie blu di altri microrganismi
Figura 1 – StrepB agar con colonie fucsia di streptococchi di gruppo B (es. S. agalactiae) e colonie blu di altri microrganismi. [Fonte: tpm-tpm.com.tw]

Composizione e preparazione

Il terreno è dato da una base in polvere (B) e da due supplementi (S1 + S2) dalla seguente composizione (Tab.1):

Prodotto = Base (B) +Supplemento (S1) +Supplemento (S2)
Totale (g/l)44,708,000,25
ComposizioneAgar (15,0)
Sali (7,5)
Peptone ed estratto di lievito (20,0)
Miscela cromogena (2,2)
Fattori di crescita (8,00)Miscela selettiva (0,25)
AspettoPolvereLiquidoPolvere
Conservazione15-30°C15-30°C2-8°C
Tabella 1 – Descrizione della composizione del terreno. [Fonte: CHROMagar Scheda Tecnica]

Il pH finale del mezzo deve essere di 7,3 +/- 0,2.

Per quanto riguarda la preparazione di 1 l di miscela, è necessario seguire questi passaggi:

Fase 1 (Base + S1)

  • Sciogliere con attenzione 44,7 g di polvere base (B) in 1 l di acqua purificata;
  • Aggiungere 8 ml di supplemento (S1);
  • Mescolare fino a quando l’agar non si solidifica del tutto;
  • Autoclavare a 121°C per 15 minuti;
  • Far raffreddare fino a 45-50°C, in agitazione.

Fase 2 (S2)

  • Versare in un recipiente trasparente 250 mg di supplemento (S2) e 10 ml di acqua purificata;
  • Mettere in agitazione fino al complemento scioglimento di S2.

Fase 3 (Base + S1 + S2)

  • Filtrare asetticamente S2 e aggiungerne 10 ml alla fase 1 (Base + S1) raffreddata a 45-50°C;
  • Mescolare delicatamente per omogenizzare.

Fase 4 (Versamento)

  • Versare la fase 3 (Base + S1 + S2) in una piastra Petri;
  • Lasciar solidificare fino a che il mezzo diventa trasparente.

Fase 5 (Conservazione)

  • Conservare al buio prima dell’utilizzo;
  • Il terreno pronto può essere conservato per un giorno a temperatura ambiente, oppure per un mese se refrigerato a 2-8°C (sempre al buio).

Metodo

I campioni utilizzabili possono essere di diversa natura, come campioni urinari, rettali o vaginali. Questi possono essere direttamente seminati sul terreno, previo un passaggio in brodo d’arricchimento (es. Todd Hewitt).
Se il terreno è stato refrigerato, prima di seminarci i campioni, è consigliabile riportarlo a temperatura ambiente.
Dopo aver seminato il campione, il terreno va incubato a 35-37°C per 18-24 h, in condizione di aerobiosi.

Risultati attesi

La lettura delle colonie sul terreno StrepB agar è puramente qualitativa.
L’interpretazione è riportata nella Tab.2 seguente:

MicrorganismoAspetto delle colonie
Streptococcus agalactiae (Gruppo B)fucsia, violette
Enterococcus spp.blu metalliche
Lactobacilli, Leuconostoc
Lactococci
rosa chiare
parzialmente inibiti
Altri microrganismiblu, incolori o inibite
Tabella 2 – Descrizione dell’aspetto delle colonie di differenti microrganismi su StrepB agar. [Fonte: CHROMagar Scheda Tecnica]

Immagini

I risultati della crescita sono osservabili in Fig. 23:

Colonie fucsia/violette di S. agalactiae su StrepB
Figura 2 – Colonie fucsia/violette di S. agalactiae su StrepB. [Fonte: eolabs.com]
Colonie di Enterococcus spp. blu metalliche su StrepB
Figura 3 – Colonie di Enterococcus spp. blu metalliche su StrepB. [Fonte: Bio-Rad Laboratories]

Limitazioni

Ci sono diverse limitazioni dello StrepB agar che vanno conosciute:

  • La sua incubazione in atmosfera arricchita con CO2 può dare falsi positivi;
  • L’identificazione finale di S. agalactiae va comunque data con le conferme di test biochimici (es. CAMP test), immunologici (Es. agglutinazione del lattice) e in spettrofotometria di massa (Es. Maldi-Tof);
  • Alcuni e rari ceppi di streptococchi di gruppo B possono richiedere ulteriori 24 h di incubazione per formare colonie visibili;
  • Specifici microrganismi come Aerococcus, Lactobacillus e Leuconostoc possono formare colonie violette chiare, confondibili con quelle di S. agalactiae.
  • La maggior parte degli streptococchi di gruppo A formano colonie fucsia/violette che danno falso positivo. Tuttavia, si possono differenziare da quelle del gruppo B tramite il PYR test (PYR test positivo –> Gruppo A, PYR test negativo –> Gruppo B);
  • Alcuni stafilococchi possono formare colonie violette differenziabili, tuttavia, tramite il test della catalasi (catalasi negativa –> streptococchi gruppo B, catalasi positiva –> stafilococchi).

Controllo qualità

Per il controllo qualità di StrepB agar si possono sfruttare i microrganismi riportati in Tab.3:

MicrorganismiAspetto delle colonie
S. agalactiae ATCC® 12386violette
S. agalactiae ATCC® 13813violette
E. faecalis ATCC® 29212blu metallico
E. coli ATCC® 25922inibito
Tabella 3 – Criteri per il controllo qualità del terreno. [Fonte: CHROMagar Scheda Tecnica]

Fonti

Crediti immagini
Crediti tabelle
Approfondimenti e curiosità
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