Strep Test – agglutinazione degli streptococchi

Con “Strep test” si fa riferimento ad un test di agglutinazione rapida per diversi gruppi di streptococchi suddivisi in base alla classificazione di Lancefield.
Il test si basa sull’utilizzo di sospensioni di lattice dei gruppi A, B, C, D, F e G, i cui antigeni specifici vengono identificati tramite anti-siero omologhi estratti preventivamente.

Principio

L’identificazione degli streptococchi può derivare da un’analisi del tipo di emolisi indotta dalle colonie cresciute su agar sangue, oppure dalla rilevazione degli antigeni poliosidici specifici della parete cellulare.
Quest’ultimo metodo si basa sulla classificazione elaborata dalla microbiologa statunitense Rebecca Lancefield nel 1933.
Lancefield identificò il determinante antigenico degli streptococchi, ovvero il polisaccaride C composto da uno scheletro costante di L-ramnosio da cui si dipartono catene variabili terminanti in esosamina.
E’ proprio la struttura di questo polisaccaride C a rendere gli streptococchi suddivisibili in 18 gruppi (Tabella 1) dalla A alla V (non esistono i gruppi I e J).

I ceppi appartenenti ai gruppi sopra indicati (A, B, C, D, F e G) sono principalmente beta-emolitici, sebbene vi siano alcune eccezioni alfa-emolitiche o non emolitiche (es. Streptococcus bovis).
I membri dei gruppi A, C e G sono solitamente patogeni umani, mentre i membri dei gruppi B, D e F sono generalmente commensali della mucosa orale, intestinale e genitale.
Gli streptococchi possono essere responsabili di numerose infezioni come faringiti, infezioni cutanee e sepsi.

Nello specifico:

• febbre reumatica e glomerulonefrite (gruppo A)
• meningiti e setticemie (gruppo B)
• infezioni post-chirurgiche (gruppo C)
• infezioni del tratto urinario ed endocardite (gruppo D).

Metodo

Il test è basato su una semplice estrazione enzimatica. L’antigene presente nell’estratto viene perciò identificato tramite particelle di lattice rivestite di anticorpi omologhi specifici del gruppo.
Se l’antigene specifico è presente nell’estratto, le particelle di lattice agglutinano, al contrario, se non è presente la sospensione resterà omogenea (Vid.1).

Come prima cosa, dunque, è necessario preparare l’estratto enzimatico.
E’ necessario prelevare dalle 5 alle 10 colonie di streptococco fresco, sviluppatesi su agar sangue o su agar CNA, per poi stemperarle in 300 microlitri di soluzione enzimatica fino ad ottenere una sospensione omogenea. Se il diametro delle colonie è inferiore a 0,5 mm, si può aumentare la dimensione dell’inoculo fino a raggiungere una torbidità evidente in provetta.
Quest’ultima va incubata dai 15 ai 45 minuti a temperatura ambiente (18-30°C), oppure, dai 10 ai 30 minuti a 37°C.
Al termine del periodo di incubazione, si posizionano 40 microlitri di sospensione di estratto in ciascun cerchio del cartoncino per agglutinazione (Fig.1).
Successivamente, si procede con l’aggiunta di una goccia di ciascun reagente (contenente gli anticorpi omologhi A, B, C, D, F e G) alla periferia di ogni cerchio.
E’ poi necessario miscelare il tutto con l’apposito bastoncino sterile, per poi emulsionare il contenuto di ogni cerchio con movimenti rotatori per circa un minuto.

Risultati attesi

L’avvenuta agglutinazione è visibile ad occhio nudo e deve essere osservata nel giro di massimo un minuto.
Una reazione positiva (Fig. 2) è data dalla formazione di aggregati rossi su sfondo verde; l’agglutinazione marcata con solo una delle sei sospensioni, definisce in modo convincente il gruppo del ceppo testato.

Una reazione negativa (Fig.2) è data da una sospensione marroncina omogena, totalmente priva di aggregati; non si conclude un risultato negativo prima del termine (un minuto) previsto.
Dimensioni e velocità di sviluppo degli aggregati dipendono dalla concentrazione dell’antigene nella soluzione dell’estratto.

Limiti del test

Come tutti i test di laboratorio, anche lo Strep Test presenta delle limitazioni.

• E’ possibile ottenere dei risultati errati se si utilizza un numero di colonie non corretto per l’estrazione.
• Alcuni ceppi di S. dysgalactiae possono agglutinare con lattice abbinato agli anticorpi di tipo C.
• Ceppi rari di Corynebacterium possono agglutinare con lattice abbinato agli anticorpi di tipo B, tuttavia, le dimensioni e la morfologia delle colonie permettono la distinzione dagli streptococchi.
• Alcuni ceppi di Enterococcus (E. durans, E. gallinarum, faecium) possono non agglutinare con lattice abbinato agli anticorpi D.
• Come per tutte le diagnosi di laboratorio, il responso finale non può basarsi su un singolo test, bensì su una panoramica di risultati biochimici, citologici e immunologici.

Quality control

I reagenti contenenti lattice devono risultare omogenei dopo l’agitazione.
E’ possibile dispensare una goccia di controllo positivo per ogni cerchio del cartoncino di agglutinazione, per poi addizionare i reagenti.
Il tutto va miscelato con l’apposito bastoncino sterile e poi ruotato per un minuto.
Al termine del processo si osserva l’avvenuta agglutinazione.

Come controllo negativo è possibile utilizzare alcune gocce di soluzione fisiologica sterile.
I reagenti non devono essere utilizzati se non producono agglutinazione dei controlli positivi o se, al contrario, inducono agglutinazione nel controllo negativo.

Fonti

• Pastorex Strep – Test di agglutinazione per gli streptococchi di raggruppamento A, B, C, D, F, G.
• Lancefield Rc. A serological differentiation of human and other groups of hemolytic streptococci. Journal of Experimental Medicin, 1933, 57, 572-95.
• Kavi J. and Wiser R. Group A heamolitic Streptococcus causing disseminated intra vascular coagulation and maternal death, The Lancet, 1988, 993-994.
• Classificazione di Lancefield, Manuali MSD.
• Classificazione di Lancefield, Wikipedia.

Crediti immagini

• Tabella 1: http://www.medical-labs.net/;
• Figura 1: Pastorex Strep: A,B,C,F,G – Labiolytic AS;
• Figura 2: DIAMET SIA|Latex agglutination tests.

Crediti video

• Latex agglutinantion for Streptoccocus grouping