Utilizzo
Il terreno di coltura di Fletcher viene utilizzato per la determinazione di Leptospira spp. (Figura 1) in campioni clinici (urine, sangue e tessuti). Si tratta di un terreno arricchito, semisolido e selettivo.
L’eventuale aggiunta di 5-fluorouracile è raccomandata soprattutto quando si utilizza un campione di urine per l’isolamento. In questo modo, si inibisce la maggior parte della flora batterica a favore della crescita di Leptospira spp.
Composizione del terreno
Terreno di Fletcher: composizione su 920 ml H2O
- Peptoni 0.3 g
- Estratto di carne 0.2 g
- Cloruro di sodio 0.5 g
- Siero di coniglio 80 ml
- Agar 1.5 g
Possibile supplemento di 5-fluorouracile se utilizzato per campioni di urine o altri fluidi biologici.
pH 7.9 ± 0.1
Come funziona?
Nel terreno di Fletcher, i peptoni e l’estratto di carne assicurano la fornitura di aminoacidi e di sostanze azotate utili per la crescita batterica.
Il cloruro di sodio, invece, garantisce la presenza di ioni essenziali. Mentre il 5-fluorouracile, analogo della pirimidina, inibisce la crescita di molte specie batteriche, senza interferire con quella di Leptospira spp.
La crescita di Leptospira spp. si può confermare a 48h dall’incubazione: osservando il terreno, infatti, si può notare un alone discoidale o ad anello appena sotto la superficie. Questa caratteristica prende il nome di “Fenomeno di Dinger” (Figura 2) (più comunemente riportato come “anello” o “disco” di Dinger).
Preparazione del terreno
- Sospendere 2,5 grammi in 920 ml di acqua distillata e mescolare accuratamente.
- Riscaldare agitando la soluzione e far bollire per 1 minuto, fino a completo dissolvimento del terreno.
- Lasciare in autoclave a 121°C per 15 minuti.
- Aggiungere siero di coniglio a 56 °C e mescolare.
- Porre 5-7 ml di terreno in microprovette con tappo a vite e lasciarle a temperatura ambiente “overnight”.
Risultati della crescita
| Batterio | Caratteristiche della crescita |
| Leptospira interrogans serotype australis | Crescita buona |
| Leptospira interrogans serotype canicola | Crescita buona |
| Leptospira kirschneri | Crescita buona |
Immagini
[fonte: researchgate.net]
Limitazioni all’utilizzo del terreno
La preparazione del terreno si rende difficoltosa negli ultimi passaggi, quando è necessario controllare ed aggiustare il pH.
Inoltre, la crescita batterica deve essere valutata dopo almeno 5 giorni, il che rende lenta la fase di identificazione. Infine, serve conoscere la progressione della malattia, poiché è più probabile trovare Leptospira spp. nel sangue entro la prima settimana.
