Terreno di Fletcher

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Utilizzo

Il terreno di coltura di Fletcher viene utilizzato per la determinazione di Leptospira spp. (Figura 1) in campioni clinici (urine, sangue e tessuti). Si tratta di un terreno arricchito, semisolido e selettivo.

Leptospira interrogans al microscopio elettronico
Figura 1 – Leptospira interrogans al microscopio elettronico [fonte: wikipedia.org]

L’eventuale aggiunta di 5-fluorouracile è raccomandata soprattutto quando si utilizza un campione di urine per l’isolamento. In questo modo, si inibisce la maggior parte della flora batterica a favore della crescita di Leptospira spp.

Composizione del terreno

Terreno di Fletcher: composizione su 920 ml H2O

  • Peptoni 0.3 g
  • Estratto di carne 0.2 g
  • Cloruro di sodio 0.5 g
  • Siero di coniglio 80 ml
  • Agar 1.5 g

Possibile supplemento di 5-fluorouracile se utilizzato per campioni di urine o altri fluidi biologici.

pH 7.9 ± 0.1

Come funziona?

Nel terreno di Fletcher, i peptoni e l’estratto di carne assicurano la fornitura di aminoacidi e di sostanze azotate utili per la crescita batterica.
Il cloruro di sodio, invece, garantisce la presenza di ioni essenziali. Mentre il 5-fluorouracile, analogo della pirimidina, inibisce la crescita di molte specie batteriche, senza interferire con quella di Leptospira spp.

La crescita di Leptospira spp. si può confermare a 48h dall’incubazione: osservando il terreno, infatti, si può notare un alone discoidale o ad anello appena sotto la superficie. Questa caratteristica prende il nome di “Fenomeno di Dinger” (Figura 2) (più comunemente riportato come “anello” o “disco” di Dinger).

Preparazione del terreno

  • Sospendere 2,5 grammi in 920 ml di acqua distillata e mescolare accuratamente.
  • Riscaldare agitando la soluzione e far bollire per 1 minuto, fino a completo dissolvimento del terreno.
  • Lasciare in autoclave a 121°C per 15 minuti.
  • Aggiungere siero di coniglio a 56 °C e mescolare.
  • Porre 5-7 ml di terreno in microprovette con tappo a vite e lasciarle a temperatura ambiente “overnight”.

Risultati della crescita

BatterioCaratteristiche della crescita
Leptospira interrogans serotype australisCrescita buona
Leptospira interrogans serotype canicolaCrescita buona
Leptospira kirschneriCrescita buona

Immagini

Terreno di Fletcher con inoculo di campione positivo a Leptospira spp.
Da notare l'anello di Dinger sotto la superficie.
Figura 2 – Colonie di Leptospira in terreno di Fletcher. Si può apprezzare al centro la formazione dell’anello caratteristico
[fonte: researchgate.net]

Limitazioni all’utilizzo del terreno

La preparazione del terreno si rende difficoltosa negli ultimi passaggi, quando è necessario controllare ed aggiustare il pH.
Inoltre, la crescita batterica deve essere valutata dopo almeno 5 giorni, il che rende lenta la fase di identificazione. Infine, serve conoscere la progressione della malattia, poiché è più probabile trovare Leptospira spp. nel sangue entro la prima settimana.

Fonti

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