Controllo microbiologico: TAMC e TYMC

Il controllo microbiologico delle materie prime e dei prodotti finiti (cosmetici/farmaceutici/alimentari) è necessario per assicurare la sicurezza e la qualità del prodotto.

Uno dei parametri importanti nel controllo qualità microbiologico è la ricerca e valutazione della carica microbica o bioburden. Il bioburden è la popolazione di microrganismi vitali presente in un prodotto prima del processo di sterilizzazione. Essi possono essere virali, batterici, fungini e possono provenire da tre fonti principali: l’ambiente di produzione, il personale della produzione, e le materie prime compresa l’acqua. Alcuni organismi sono generatori di spore, che sono generalmente quelli più resistenti agli stress ambientali, compresi i processi di sterilizzazione.

TAMC e TYMC

Secondo la Farmacopea Europea, gli esami microbiologici di prodotti non sterili presentano fasi di: Processamento, Trasferimento in un mezzo di coltura, Incubazione e Interpretazione dei risultati (Figura 1), ed hanno come obiettivi la determinazione di due indici:

  • TAMC (total aerobic microbial count) ovvero la conta dei batteri aerobi totali;
  • TYMC (total combined yeast/moulds count) ovvero la conta di muffe e lieviti.

e la ricerca di particolari microrganismi (principalmente E. coli, S. aureus, P. aeruginosa).

conta microbica
Figura 1 – Conta microbica

I metodi diretti e indiretti

Le tecniche per eseguire la conta microbica sono molteplici. Distinguiamo principalmente metodi diretti e indiretti.

  • I metodi diretti (es. la conta al microscopio) non distinguono fra cellule vive e cellule morte;
  • I metodi indiretti (o colturali) invece prevedono la conta delle sole cellule vive, ovvero le uniche in grado di riprodursi e formare colonie (Unità Formanti Colonia, UFC) nei terreni di coltura.

Tutti i metodi, comunque si basano sull’utilizzo di una diluizione del campione. Il diluente comunque non deve influire sui microrganismi né negativamente (rallentando o impedendone la sopravvivenza) né positivamente (favorirne lo sviluppo). Tra i principali diluenti utilizzati troviamo:

  • La soluzione di Ringer (pH 7) a base di sali e acqua distillata;
  • Soluzione fisiologica;
  • Acqua peptonata salina;
  • Acqua triptonata 1%.

Tecniche dirette: la camera conta-cellule

Per la conta diretta delle cellule si utilizza una apposita camera (detta camera di Burker), in cui si dispone da 100µl a 1ml di campione: la camera è costituita da scomparti (Figura 2). Proceduralmente:

  • Si contano le cellule presenti in una frazione di superficie;
  • Si moltiplica per 25 cellule (cellule/mm2) e quindi per 10 (altezza della camera);
  • In questo modo si ottiene il numero di cellule per mm3;
  • Per rapportare questo valore al ml occorre moltiplicare ancora per 1000.
camera di burker
Figura 2 – Principio della camera di Burker

Tecniche indirette

Le tecniche indirette si basano tutte sulla coltivazione di aliquote del campione mediante varie modalità di semina (Figura 3) in piastra (in superficie o per inclusione).

tecniche di semina microbiologica
Figura 3 – Tecniche di semina

La modalità di semina dipende dallo scopo della semina stessa.

semina per inclusione
Figura 4 – Tecnica di semina per inclusione

Tra i metodi indiretti del controllo microbiologico c’è anche l’utilizzo delle membrane filtranti (Figura 5): ovvero, il campione viene filtrato attraverso una membrana di cellulosa dotata di micropori (0,4-0,2 µm). I microrganismi presenti nel campione rimangono sulla superficie di membrana, che viene poi deposta sulla superficie di una piastra Petri con terreno sterile adatto allo sviluppo dei microrganismi ricercati. Le piastre vengono poi incubate in termostato e lette per la presenza di microrganismi (Figura 5).

tecnica membrana filtrante
Figura 5 – Conta microbica con membrana filtrante

Tecnica MPN (Most Probable Number)

Questa tecnica si basa sulla distribuzione casuale e non uniforme dei microrganismi nel campione e sull’elaborazione statistica dei risultati.

Operativamente si allestiscono 3 serie di colture in provette (3 o 5 provette per ogni serie) che contengono la stessa quantità di campione. Ogni serie viene inoculata con aliquote decrescenti del campione (Figura 6) e si valuta, sul totale di provette per ogni serie, quelle positive (per torbidità e sviluppo di gas). I risultati vengono poi interpretati alla luce di una tabella statistica.

most probable number
Figura 6 – Metodo del Most Probable Number

Terreni

I terreni utilizzati per la TAMC sono principlamente:

Mentre il terreno utilizzato per la TYMC è lSDA (Sabouraud Dextrose Agar).

Nela seguente tabella sono riportate le principali analisi che si eseguono e le relative condizioni di crescita dei microrganismi.

analisi condizioni di crescita e terreni
Figura 7 – Analisi, condizioni di crescita e terreni TAMC e TYMC

Fonti

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