DNase Test Agar

Utilizzo

Il DNase Test Agar (Fig.1) è un terreno di coltura utilizzato per il differenziamento dei microrganismi, basato sulla loro eventuale attività desossiribonucleasica (DNasica).
Su questo terreno si possono seminare direttamente i campioni per l’isolamento, oppure si possono riseminare le colture pure precedentemente ottenute.
Nel 1956, Weckman e Catlin si resero conto che in presenza di una forte attività coagulasica positiva di Staphylococcus aureus, si poteva altrettanto osservare un incremento evidente dell’attività desossiribonucleasica.
Quest’associazione di eventi (poi confermata da DiSalvo e collaboratori) suggerì che quest’ultima potesse essere sfruttata come indicatore della presenza di stafilococchi patogeni.

DNase Test Agar con colonie di microrganismi dall'attività desossiribonucleasica messa in evidenza dall'alone circostante
Figura 1 – DNase Test Agar con colonie di microrganismi dall’attività desossiribonucleasica messa in evidenza dall’alone circostante. [Fonte: fishersci.nl]

Per queste ragioni, anni dopo, Jeffries, Holtman e Guse svilupparono un terreno di coltura (DNase Test Agar) con incorporati frammenti di DNA (Acido DesossiriboNucleico), utili per studiare l’attività desossiribonucleasica di batteri e funghi.

Composizione e conservazione

Il DNase Test Agar contiene triptone come principale fonte nutrizionale, inoltre, il cloruro di sodio mantiene l’equilibrio osmotico e i frammenti di DNA permettono di evidenziare un’eventuale attività enzimatica (DNasica).
Dopo aver incubato il terreno di coltura seminato con il ceppo microbico di interesse, la piastra viene inoculata con alcune gocce di acido cloridrico che precipita i frammenti di DNA depolimerizzati dall’attività enzimatica, rendendo il terreno di coltura opaco. I microrganismi che esprimono questi enzimi, perciò, appaiono sul terreno come circondati da un evidente alone opaco.

Questo terreno è indicato per l’identificazione degli stafilococchi, ma anche per evidenziare un’eventuale attività DNasica di altri microrganismi; la sua formula per litro di acqua purificata è riportata in Tabella 1:

IngredientiQuantità (g/l)
Triptone20,0
Cloruro di sodio5,0
DNA2,0
Agar15,0
Tabella 1 – Formula di preparazione del terreno di coltura, può essere corretta in base alle esigenze del momento e possono essere addizionati coloranti per le varianti. [Fonte: BD Scheda tecnica].

Al ricevimento, le piastre devono essere conservate al buio e tra i 2 e gli 8°C, nella loro confezione originale.
I terreni possono essere utilizzati fino alla data di scadenza ed incubati in relazione al tipo di microrganismo in questione.
Il pacco da dieci piastre può essere utilizzato entro una settimana dall’apertura, se conservato in una zona pulita e con temperatura compresa tra 2 e 8°C.

Metodo

L’inoculo di partenza può essere prelevato da una coltura precedente (es. su Columbia Agar sangue) e seminato sul terreno a spot (cerchietto localizzato), o tramite una piccola riga di circa 4 cm (Vid. 1), o ancora a spirale (4 cm- Fig.4); è possibile seminare più microrganismi sullo stesso terreno (da 1 a 4).

Video 1 – Procedura d’utilizzo del DNase Test Agar. [Fonte: Dnase test principle procedure results]

E’ raccomandabile inserire sempre un controllo negativo (Es. Staphylococcus epidermidis) e uno positivo (Es. S. aureus), per poi incubare il terreno per 18-24 h a 35-37°C in aerobiosi.
Al termine del periodo di incubazione sarà possibile addizionare 1 N di acido cloridrico (HCl) che dovrà poi essere lasciato penetrare nel mezzo per almeno due minuti.

Risultati

Quando l’acido cloridrico fa effetto, i microrganismi con attività DNasica (Es. S. aureus e S. marcescens) risultano circondati da un evidente alone di depolimerizzazione del DNA, dall’aspetto opaco e più chiaro rispetto al resto del terreno. Al contrario, quelli privi di questa attività formeranno colonie senza alcun alone circostante.

Immagini

L’aspetto dei terreni DNase Test Agar sono visibili in Fig. 2,3 e 4:

DNase Test Agar con blu di toluidina: visibile nella parte centrale l'alone di inibizione lasciato dalle colonie di microrganismi con attività positiva
Figura 2DNase Test Agar con blu di toluidina: visibile nella parte centrale l’alone di inibizione lasciato dalle colonie di microrganismi con attività positiva. [Fonte: fishersci.com]
DNase Test Agar con verde di metile. Nella zona centrale le colonie di microrganismi mostrano attività positiva correlata dallo sviluppo di un evidente alone più chiaro sul terreno
Figura 3 DNase Test Agar con verde di metile. Nella zona centrale le colonie di microrganismi mostrano attività positiva correlata dallo sviluppo di un evidente alone più chiaro sul terreno. [Fonte: ReserchGate].
Nase Test Agar con verde di metile: a sinistra il terreno non inoculato, al centro inoculato con S. aureus e Streptococcus pneumoniae dopo 48 h di incubazione, a destra inoculato con S. aureus e Streptococcus pneumoniae dopo 24 h di incubazione (già visibile l'alone giallo)
Figura 4DNase Test Agar con verde di metile: a sinistra il terreno non inoculato, al centro inoculato con S. aureus e Streptococcus pneumoniae dopo 48 h di incubazione, a destra inoculato con S. aureus e Streptococcus pneumoniae dopo 24 h di incubazione (già visibile l’alone giallo). [Fonte: kisanbio.com]

Limitazioni

Il DNase Test Agar è un terreno di coltura adatto ad evidenziare l’attività desossiribonucleasica di alcuni ceppi microbici: viene sfruttato principalmente per l’identificazione di S. aureus e per il suo differenziamento da S. epidermidis.
Tuttavia, può evidenziare anche l’attività DNasica di altri microrganismi, oppure può essere sfruttato per differenziare Serratia da Klebsiella/Enterobacter.
Al di là di un’eventuale attività DNasica positiva, sono comunque richiesti ulteriori test biochimici/sierologici per una sicura identificazione.

Controllo qualità

Per il controllo qualità, alcuni specifici microrganismi (Tabella 2) devono essere ri-seminati a spot, o con una striscia di 4 cm sul terrreno DNase Test Agar, dopo essere stati seminati su un terreno di coltura standard come un Columbia Agar sangue.
Il terreno va poi incubato per 18-24 h in condizioni di aerobiosi. Al termine dell’incubazione, anche in questo caso, va aggiunto l’HCl 1 N che dovrà essere lasciato agire per due minuti.

MicrorganismoRisultato del Test
Staphylococcus aureus ATCC 25923DNasi positivo
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228DNasi negativo
Serratia marcescens ATCC 13880DNasi positivo
Klebsiella pneumoniae ATCC 33495DNasi negativo
Non inoculatoAspetto classico del terreno di coltura, senza colonie e senza aloni
Tabella 2 – Microrganismi per il controllo qualità e risultati attesi. [Fonte: BD scheda tecnica].

Fonti

  • BD Scheda Tecnica;
  • Zetalab.it;
  • Weckman, B. G., and B. W. Catlin. 1957. Deoxyribonuclease activity of micrococci from clinical sources. J. Bacteriol. 73: 747-753.
  • DiSalvo, J. W. 1958. Deoxyribonuclease and coagulase activity of micrococci. Med. Tech. Bull. U. S. Armed Forces Med. J. 9: 191.
Crediti tabelle
Crediti immagini
Crediti video
Foto dell'autore

Giulia Baldi

Biologa A iscritta all'albo professionale. Laureata in Scienze Biologiche e in Biologia Agro-Ambientale con tirocini in ambito clinico (laboratorio di microbiologia e virologia) e ambientale (laboratorio di ricerca in interazioni pianti-ambiente). Master di II livello in Sicurezza Alimentare e Sistemi di Gestione.

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