ELISA: principi delle tecniche immunochimiche ed esempi di saggi

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ELISA è l’acronimo di enzyme-linked immunosorbent assay (saggio immuno-assorbente legato ad un enzima). Si tratta di un versatile metodo d’analisi immunologica che rientra nella categoria dei test immunoenzimatici

In questo tipo di saggi analitici, una sostanza da dosare (definita analita) si lega ad un’altra (generalmente rappresentata da un anticorpo) che ne rileva la presenza. Il metodo ELISA ha come fine il rilevamento e l’identificazione (sia qualitativa che quantitativa) di una sostanza specifica all’interno di un campione.

Prima del suo sviluppo, l’unica opzione per condurre un saggio immunologico era riconducibile ad una tecnica che utilizza antigeni o anticorpi marcati radioattivamente. Poiché la radioattività pone una potenziale minaccia per la salute, il test ELISA ha rappresentato un’alternativa più sicura.

Nel 1971, Peter Perlmann e Eva Engvall (Università di Stoccolma) e Anton Schuurs e Bauke van Weemen (Paesi Bassi) pubblicarono, in modo indipendente, le loro conoscenze sui metodi per eseguire EIA/ELISA.

Principi delle tecniche immunochimiche

L’immunochimica è una disciplina immunologica che si prefigge di studiare gli antigeni, gli anticorpi e l’interazione antigene-anticorpo.

L’antigene è quella sostanza che, in opportune condizioni, è in grado di indurre la formazione di uno o più anticorpi, reagendo specificatamente con questi. D’altra parte, gli anticorpi sono sostanze di natura glicoproteica definiti anche come immunoglobuline o gamma globuline. La produzione di anticorpi si ottiene per differenziazione delle plasmacellule a seguito dell’azione della risposta immunitaria.

diverse classi di immunoglobuline
Figura 1- Esistono diverse classi di immunoglobuline che vengono denominate sulla base delle “5 catene pesanti” in IgA, IgD, IgE, IgG, IgM

L’interazione che si instaura tra antigene e corrispondete anticorpo porta alla formazione di quello che viene definito come immunocomplesso (la natura del legame è di tipo non covalente e reversibile). L’analita o gli anticorpi, sono marcati con una sostanza definita tracciante che permette il rilevamento e può essere un radioisotopo, un composto fluorescente o un enzima.

La specificità delle reazioni antigene-anticorpo e la sensibilità dei “marcatori” possono essere combinate insieme per compiere un “dosaggio immunologico”, ossia quantificare con precisione una sostanza antigenica. La tecnica più usata è il dosaggio radioimmunologico (RIA), in cui il tracciante è costituito da un isotopo. Quando, invece, il tracciante è costituito da un enzima, si parla di dosaggi immunoenzimatici (EIA).

Traccianti più comuni per la rilevazione del complesso antigene-anticorpo

Nell’immunochimica sono diversi gli enzimi utilizzabili come traccianti. Tra i più noti ritroviamo la perossidasi (HRP), una molecola classificata nel gruppo delle ossido reduttasi: si estrae dalla radice delle piante di rafano (Cochlearia armoracia) e svolge attività antiossidante, contribuendo a preservare le cellule e i tessuti dagli effetti dannosi delle sostanze prodotte dall’attività ossidasica in vivo. La perossidasi agisce, quindi, da catalizzatore di una reazione di ossido-riduzione, nella quale un substrato rilascia elettroni che ossidano un cromogeno.

Un secondo importante tracciante è la fosfatasi alcalina (nell’isoforma estratta dall’intestino di bue). La colorazione si sviluppa in seguito all’idrolisi enzimatica degli esteri che costituisco il substrato, che si scindono in composti fenolici e fosfati. A questo punto, i composti fenolici si uniscono con il cromogeno per formare il prodotto colorato.

L’immunodosaggio può essere rilevato anche grazie al complesso avidina-biotina. L’avidina è una proteina presente nel bianco dell’uovo, in grado di legare con alta affinità la biotina. Quest’ultima, può coniugarsi ad altre proteine senza alterare le loro caratteristiche e mantenendo inalterata la sua affinità per l’avidina. Quindi, queste proprietà sono fruttante per la rilevazione colorimetrica del complesso antigene-anticorpo, dove è molto importante preservare l’integrità del legame per avere un’alta sensibilità e specificità della reazione.

Saggio ELISA

Il test ELISA si basa sull’utilizzo di anticorpi marcati con un enzima (generalmente la perossidasi), in modo che i coniugati risultanti abbiano una attività sia immunologica che enzimatica. Avendo uno dei componenti (antigene o anticorpo) adeso alla piastra, la reazione antigene-anticorpo è immobilizzata e pertanto potrà facilmente essere evidenziata con l’addizione del substrato che, reagendo con l’enzima, produrrà una colorazione osservabile a vista e quantificabile con lo spettrofotometro.

ELISA diretto o a “sandwich”

Nel test ELISA diretto, l’antigene è adeso alla base del supporto solido e la sua presenza può essere rilevata attraverso l’utilizzo di un anticorpo marcato con un enzima che, se fatto reagire con un opportuno substrato, permette l’osservazione di un complesso (prima incolore) che adesso produrrà una colorazione apprezzabile.

Analizzando più da vicino il metodo diretto a sandwich, per determinare la presenza di un determinato antigene in un campione biologico, è necessario seguire delle fasi consequenziali:

  • Fissaggio al substrato dell’anticorpo primario specifico per l’antigene da ricercare;
  • Lavaggio per eliminare l’eccesso di anticorpo;
  • Aggiunta del campione da saggiare per la presenza o meno dell’antigene;
  • Lavaggio per togliere antigeni in eccesso;
  • Aggiunta di un anticorpo secondario specifico per l’antigene coniugato a un enzima specifico (perossidasi o fosfatasi alcalina). Se l’antigene è presente l’anticorpo si legherà selettivamente al complesso anticorpo-antigene, formando un triplo strato da cui prende il nome il test;
  • Lavaggio con soluzione tampone dell’eccesso;
  • Aggiunta del substrato per l’enzima coniugato all’anticorpo che porterà alla formazione di un prodotto colorato;
confronto tra ELISA diretto e ELISA sandwich
Figura 2 – Confronto tra ELISA diretto e ELISA sandwich

In linea generale, lo sviluppo del colore è indicativo della presenza dell’antigene che si voleva saggiare e l’intensità della colorazione è semi-quantitativa e misurabile attraverso l’uso dello spettrofotometro.

ELISA indiretto

La procedura implica l’uso di un anticorpo secondario marcato che sia in grado di riconoscere la regione costante dell’anticorpo primario, precedentemente incubato in fase solida. In questa metodica, a differenza delle precedenti descritte, è importante determinare la presenza di un determinato anticorpo.

I passaggi sono i seguenti:

  • Fissaggio al substrato dell’antigene specifico per l’anticorpo che vogliamo misurare;
  • Lavaggio per eliminare l’eccesso di antigene;
  • Aggiunta del siero (campione) che si vuole saggiare per ricercare la presenza di anticorpi;
  • Lavaggio per eliminare l’eccesso di anticorpi che non hanno legato l’antigene;
  • Aggiunta di un anti-anticorpo, cioè un anticorpo secondario marcato con un enzima che legherà, se presenti, gli anticorpi nel campione;
  • Lavaggio per eliminare eventuali anticorpi non legati al complesso;
  • Aggiunta del substrato dell’enzima con cui è stato marcato l’anti-anticorpo: un cambiamento di colore indica la presenza degli anticorpi nel siero (campione), visto che l’enzima usato agisce sul substrato modificandolo, in maniera che assorba la luce e risulti colorato;
ELISA indiretto
Figura 3 – Rappresentazione schematica di ELISA indiretto

Vantaggi e limitazioni del saggio ELISA

L’analisi ELISA è ormai fortemente consolidata tra le tecniche di laboratorio ma non è certo infallibile.

Il vantaggio principale è l’alta sensibilità e specificità diagnostica: può essere usata per quantificare molecole contenute in vari campioni, compresi siero, plasma, urina, saliva o estratti di tessuto. Attraverso ELISA, però, sono ottenibili soltanto informazioni riguardanti la presenza o meno di determinate molecole nel nostro campione: questo è uno svantaggio notevole, soprattutto quando si vuole analizzare e caratterizzare biochimicamente ciò che il saggio ha rilevato.

Esempi applicativi

Il test ELISA ha numerose applicazioni che spaziano dalla diagnostica alla rilevazione delle intolleranze alimentari. Nel caso dell’intolleranza alimentare (mediata da immunoglobuline IgG) e dell’allergia alimentare (mediata da immunoglubuline IgE), il test può essere effettuato con un semplice prelievo di sangue capillare, anche presso le farmacie.

ELISA ha sicuramente destato attenzione per la sua capacità di verificare l’eventuale esposizione ad un determinato agente patogeno: ne è un esempio conclamato il test HIV-Ab utilizzato per diagnosticare l’eventuale presenza di anticorpi anti-HIV.

Inoltre, come non citare i test sierologici rivolti all’identificazione dell’infezione da nuovo coronavirus di cui tanto si sente parlare. Col crescere degli individui contagiati, infatti, diviene sempre più necessaria la disposizione di test di laboratorio che possano restituire un’accurata fotografia della diffusione nella popolazione del virus SARSCoV2.

In un momento di emergenza come quello che stiamo vivendo, lo strumento più idoneo è l’esame sierologico quantitativo per la ricerca degli anticorpi anti-SARS-CoV-2. I test immunologici rilevano gli anticorpi prodotti dall’organismo in risposta all’infezione di un patogeno e, inevitabilmente, devono far fronte alla variabilità intrinseca della risposta anticorpale umana, che richiede tempo per essere caratterizzata. Proprio per questo motivo, è in atto una discussione attorno ai test rapidi (test qualitativi). Invece il test ELISA, validato direttamente dallo Spallanzani di Roma e disponibile dalla fine di Aprile, è stato fornito alla Regione Toscana e costituirà un utile complemento alla diagnosi molecolare soprattutto nel caso di soggetti asintomatici, consentendo di eseguire studi epidemiologici sulla diffusione del virus. Una finalità importante, dal momento che è ormai noto che una rapida identificazione dei soggetti infetti è il primo passo per l’attuazione di misure che controllino l’ulteriore diffusione del virus tra la popolazione.

In rete è possibile trovare numerosi esempi in cui si possano osservare i vari passaggi necessari per l’esecuzione di un saggio ELISA. Vi riportiamo qui di seguito un video YouTube realizzato dal canale Edvotek Inc.:

Video che mostra i vari passaggi per realizzare un saggio ELISA

Fonti

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