Psicrotrofi: la risorsa antibiotica che viene dal freddo

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Quando il primo colpo fallisce, si rischia di cadere subito preda dell’avversario. Anche quando infinitamente più piccolo. Lo sanno bene schiere di ricercatori farmaceutici che spremono, fino all’ultima goccia, ogni nuova fonte di molecole antimicrobiche. Questa volta, sono giunti fino in Antartide per rendersi conto che dei batteri fotosintetici psicrotrofi sono anche inaspettati fornitori di sostanze antibatteriche. Bizzarrìa contra regnu della quale non tarderemo ad approfittare.

L’Antartide e i suoi psicrotrofi

Sono numerosi gli studi in grado di documentare il doppio volto ecologico delle regioni antartiche: ridotta bioversità vegetale ed animale ma ricca variabilità di forme microbiche. Si tratta di cellule batteriche adattate a temperature estremamente basse eppure autosufficienti, come solo gli autotrofi fotosintetici sanno essere. Markus Dieser e colleghi avevano, già in passato, dimostrato l’elevata frequenza di produzione di pigmenti nei cores, nei ghiacciai come nelle acque superficiali.

Batteri fotosintetici multitasking

Negli ultimi anni, gli studi sulle forme batteriche capaci di fotosintesi si sono moltiplicati. L’interesse è cresciuto, sì, per la loro estesa diffusione ambientale ma anche per le peculiarità che li rendono utili in molti settori della vita umana: cosmesi, industria alimentare, farmacologia e, non ultimo, trattamento delle acque reflue. Bioremediation, produzione di bioplastiche e di bioidrogeno sono i trend topics dei nostri tempi.

Questi batteri fotosintetici si ritrovano prevalentemente in suolo, corsi d’acqua e bacini idrici, risaie, oceani e fanghi attivi, oltre che in ambienti estremi come quelli oggetto di studio. Dimostrata è anche la loro elevata capacità di adattamento pressochè ad ogni condizione esistenziale: aerobiosi, anaerobiosi, autotrofia ed eterotrofia.

Antibiotici da batteri psicrotrofi: lo studio

Psicrotrofi sono quegli organismi che proliferano facilmente allo ψυχρός (psychrós), freddo. Essi sono in grado di crescere e moltiplicarsi a temperature comprese tra 0°C e 20°C. Così, per identificare l’optimum di temperatura di crescita della vita microbica antartica, i ricercatori, guidati da Fatin Syahirah Othman, hanno raccolto campioni di acqua oceanica presso Schollaert Channel, in Antartide. Hanno, poi, messo in coltura i microrganismi presenti nell’acqua salate a tre diverse temperature (10°C, 20°C e 30°C). Le condizioni di luce imposte hanno raggiunto i 300 lux di intensità. Il terreno di coltura liquido è stato arricchito con acetato e succinato ed aggiustato a pH 6.8 – 7.2.

Le colture sono state incubate fino ad ottenere da esse una colorazione rossa, chiara e scura. In generale, i batteri hanno mostrato di preferire, comprensibilmente, il mezzo a base di acetato e la temperatura di 30°C. A 10°C, nel mezzo liquido, non hanno manifestato pigmentazione di sorta. A 20°C è emerso un pigmento rosso scuro, mentre fotopigmenti più chiari a 30°C.

La prima crescita batterica, i ricercatori l’hanno individuata misurando la torbidità della soluzione mediante metodi spettrofotomentrici nell’UV-visibile, in grado di leggere l’assorbanza del liquido a 600 nm, ad intervalli regolari.

Purificazione delle singole colonie per stringere il cerchio

I ricercatori, una volta accertata fotometricamente la crescita microbica, hanno prelevato 200 μL delle colture e li hanno seminati su piastre di agar arricchito con succinato ed acetato, per ottenere colonie pure. Incubate a 30°C e sotto illuminazione fino alla comparsa degli esiti proliferativi. In seguito, nuovo passaggio su piastre fresche e poi, gli autori, hanno ottenuto un totale di 10 ceppi: di questi, solo uno ha mostrato una efficienza replicativa promettente e ha fatto, quindi, da modello sperimentale. Il prescelto ha mostrato, inoltre, un tipico profilo batterico di crescita: una lunga fase lag, durata più di 10 ore, una fase esponenziale di circa 5 ore ed infine una fase di morte dopo più di 20 ore dall’inizio dell’incubazione. Il tempo di generazione si è attestato su 9.24 ore.

Dimmi che colonie hai e ti dirò chi sei

Le colonie del ceppo psicrotrofo sono apparse bianche, circolari, in rilievo medio e con margini interi. Il pigmento rosso chiaro espresso in brodo di coltura con acetato, non compariva, però, sulla capsula con acetato.

Ulteriore esame morfologico delle colonie ha riguardato il comportamento del ceppo in colorazione di Gram: al microscopio ottico è apparso rosa, quindi Gram-negativo, e bastoncellare.

Analisi dei pigmenti fotosintetici: indizi chiari, precisi e concordanti

La sospensione dell’isolato è, dunque, rossa con un massimo nello spettro d’assorbimento a 800 ed a 850 nm. La prova che si tratti proprio di organismi fotosintetici è arrivata, però, dalla rilevazione di questi due picchi, caratteristici delle batterioclorofille a e b. La batterioclorofilla, infatti, contiene più anelli tetrapirrolici saturi, rispetto alla clorofilla. Questo sposta la lettura, e quindi l’identificazione, a lunghezze d’onda più alte. Secondo Hu e colleghi, i batteri fotosintetici fototrofi anaerobi virano poi verso il viola per la presenza di carotenoidi, in grado di assorbire la luce a 500 nm.

Quella inattesa attività antibatterica che farà degli psicrotrofi i nostri migliori amici

L’isolato microbico ha, inoltre, subìto un inoculo “esplorativo” per valutare eventuali capacità antibatteriche. Incubazione a 30°C per una settimana a diverse percentuali del microrganismo psicrotrofo (5%, 10%, 15%, 20% e 25% v/v) in terreni contenenti Escherichia coli (Gram-negativo) e Staphylococcus aureus (Gram-positivo). Poi monitoraggio della crescita a 600 nm.

L’analisi dell’attività antibatterica ha, inoltre, rivelato che il ceppo isolato inibisce la crescita di E. coli già ad una percentuale di inoculo inferiore al 25%. A percentuali superiori, c’è inibizione sia per E.coli che per S. aureus, mentre a percentuali pari al 25% corrispondono riduzioni di crescita batterica rispettivamente del 69% e del 66%. La prova sperimentale replicata tre volte ha dato gli stessi risultati.

L’E. coli è un batterio Gram-negativo che, quindi, possiede una parete cellulare più sottile rispetto a S. aureus, con uno straterello di peptidoglicani. Tuttavia, all’esterno di questa, presenta una barriera protettiva, essenziale per la sopravvivenza. Lo S. aureus, invece, è un batterio Gram-positivo, grandemente resistente alla maggior parte degli agenti antibatterici disponibili, quindi estremamente difficile da trattare. Le sostanze antibatteriche potrebbero renderlo inattivo, agendo su tre grandi meccanismi di resistenza:

  • produzione di enzimi che inattivino aminoglicosidasi e beta-lattamasi (prodotti enzimatici batterici che garantiscono ai patogeni la resistenza ai farmaci, detta inattivazione intracellulare dell’antibiotico);
  • alterazione delle capacità di penetrazione antibiotica nella cellula batterica;
  • alterazione del target antibiotico (per evitare la sostituzione del bersaglio).

Il ceppo sotto studio, di fatto, ha espresso capacità antibatterica ad ampio spettro, sia contro Gram-positivi che Gram-negativi.

Esame del DNA e l’identità è servita!

In ogni indagine che si rispetti, l’esame genetico ha l’ultima parola. Una volta estratto il DNA ribosomiale microbico 16S, esso ha subìto amplificazione genica mediante PCR: i suoi prodotti, dopo corsa elettroforetica ad 80 volt per 45 minuti (per assicurarsi la presenza del DNA), sono stati spediti al First Base Laboratories, in Malesia. Confrontando i geni ottenuti del ceppo isolato tra gli psicrotrofi con quelli conservati nel database della GenBank and Ribosomal Database Project, i ricercatori hanno applicato l’algoritmo BLAST. Ne è risultata una stretta omologia con Stenotrophomonas maltophilia (Fig. 1), del 99%. Il ceppo che ha guidato il lavoro di ricerca ha assunto, così, il nome di Stenotrophomonas sp. SZB2.

Stenotrophomonas maltophilia, batterio emerso per omologia con il ceppo degli psicrotrofi isolati in Antartide.
Figura 1 – Stenotrophomonas maltophilia, una volta noto come Pseudomonas maltophilia, è un patogeno nosocomiale responsabile di infezioni restistenti delle alte e basse vie aeree.
Fonte immagine al TEM: https://www.sciencephoto.com/media/81845/view

Antibiotici da psicrotrofi, di là da venire

Quel che gli autori di questo lavoro sperimentale auspicano è, di certo, una intensificazione nella ricerca dei singoli composti antibiotici microbici, responsabili di una efficacia antibatterica così democratica. Ad ampio spettro. Servirà, però, l’ausilio di metodiche estrattive e di purificazione come GC-MS (gas chromatography-mass spectrometry), LC-MS (liquid chromatography-mass spectrometry) oppure NMR (nuclear magnetic resonance spectrophotometry). Ma potremmo farcela a sondare anche questa ennesima risorsa, racchiusa in un ceppo, tutt’altro che innocuo.

La lotta per la supremazia uomo – batterio continua.

Riferimenti bibliografici

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