Intervista alle Dott.sse Danzi e Marino sulle biomasse lignocellulosiche

In questo articolo intervisteremo le Dott.sse Donatella Danzi e Ivana Marino relativamente alla valorizzazione di biomasse lignocellulosiche in un’ottica di economia circolare.

Buongiorno dott.ssa Danzi e dott.ssa Marino, lo staff di Microbiologia Italia vi ringrazia per aver accettato il nostro invito a questa intervista. Volete raccontare ai nostri lettori il vostro percorso e di cosa vi occupate attualmente?

Buongiorno e grazie a voi per l’invito e per l’opportunità di condividere con voi la nostra esperienza.

Dott.ssa Marino: “Ci siamo conosciute, nel 2015, in ALSIA Agrobios di Metaponto (Agenzia Lucana di Sviluppo e di Innovazione in Agricoltura), dove lavoro da circa 20 anni. Inizialmente impegnata nella trasformazione genetica di specie vegetali per il miglioramento delle caratteristiche nutrizionali, negli ultimi anni ho lavorato in attività che riguardano la produzione di enzimi da funghi eduli attraverso la fermentazione su substrato solido utilizzando scarti agricoli. Donatella, per conto dell’Istituto di Bioscienze e Biorisorse del Consiglio Nazionale delle Ricerche (IBBR-CNR), iniziò un periodo di lavoro come assegnista di ricerca presso l’ ALSIA Agrobios.

Abbiamo da subito pensato di combinare le nostre esperienze, per esplorare la possibilità di sfruttare le biomasse lignocellulosiche di scarto, ottenendo sostanze ad alto valore. Per diversi anni mi sono dedicata a questo mondo così vasto, in gran parte sconosciuto che è il regno dei funghi e comprende, secondo recenti stime, fino a 3 milioni di specie delle quali conosciamo solo una minima parte.

I funghi sono ovunque e possono vivere sulle rocce, nei fondali marini, nei deserti, in mezzo al ghiaccio artico, sulle foglie degli alberi, negli organismi animali. Assieme ad altri microrganismi, in natura, provvedono all’importantissima funzione di degradazione delle sostanze organiche complesse e alla loro trasformazione in sostanze inorganiche quali acqua, anidride carbonica e sali minerali, restituiti così all’ambiente circostante andando ad alimentare il nuovo ciclo biologico naturale. Rappresentano, inoltre, una fonte di enzimi industrialmente rilevante che costituiscono una soluzione più sostenibile rispetto ai reagenti chimici. L’introduzione di tali enzimi in vari processi industriali si traduce, dunque, in trasformazioni biotecnologiche più ecocompatibili.

I funghi assorbono gli alimenti attraverso la superficie del corpo vegetativo ma in questo modo possono introdurre solamente piccole molecole come gli zuccheri semplici (glucosio) e gli amminoacidi. Per poter utilizzare le sostanze organiche molto più complesse e molto abbondanti in natura come l’amido, la cellulosa, la lignina, le proteine etc., essi producono e riversano all’esterno delle loro cellule particolari enzimi litici capaci di attaccare le grosse molecole, frazionandole in composti sempre più semplici fino a ridurle a molecole più piccole e facilmente assorbibili; in definitiva si tratterebbe di una vera e propria digestione extracellulare.

Alla luce di quanto detto, i funghi si differenziano non solo dalle piante, in quanto incapaci di effettuare la fotosintesi clorofilliana, ma anche dagli animali i quali prima ingeriscono e successivamente digeriscono, al contrario, i funghi prima digeriscono a livello extracellulare e poi assimilano attraverso le pareti cellulari. I funghi condividono con i batteri la possibilità di essere coltivati in fermentatori.

La produzione di enzimi da un lato è più favorevole nei modelli fungini rispetto a quelli batterici, perché gli enzimi sono secreti nel brodo di coltura, con la conseguente notevole semplificazione della loro purificazione, d’altro canto, i processi sono meno standardizzabili perché una coltura fungina non è mai omogenea come quella batterica e le condizioni della fermentazione su substrato solido, molto utilizzata per produrre enzimi, non sono mai perfettamente ripetibili e hanno tempi molto più lunghi. Altro importante vantaggio dei funghi è che essendo un modello eucariotico, sono in grado di fornire una serie di modificazioni post-traduzionali conformi alla struttura proteica di enzimi di impiego farmacologico, cosa impossibile in sistemi di espressione batterica. Cellulasi, xilanasi, amilasi, laccasi (Fig.1) e perossidasi fungine trovano largo impiego nell’industria alimentare, tessile, cartaria e nella produzione di detersivi.”

Figura 1: Dott.ssa Ivana Marino, prove sperimentali con l'utilizzo di laccasi fungine per la degradazione della lignina.
Figura 1: Dott.ssa Ivana Marino, prove sperimentali con l’utilizzo di laccasi fungine per la degradazione della lignina.

Dott.ssa Danzi: “Come già anticipato da Ivana, abbiamo iniziato a collaborare nel 2015. Dopo aver conseguito il Dottorato di Ricerca, in Genetica e Biotecnologie Vegetali presso l’IBBR-CNR di Bari, occupandomi di utilizzo di approcci Omici per l’isolamento e la caratterizzazione di geni coinvolti nel pathway dei fenilpropanoidi in carciofo, nel 2015 ho iniziato a lavorare, come assegnista di ricerca, presso una Joint Unit Research (URT) dell’IBBR-CNR presso l’azienda sperimentale ALSIA Agrobios.

Il progetto di cui mi dovevo occupare riguardava essenzialmente la valorizzazione di risorse genetiche vegetali, in particolare di una collezione di genotipi di frumento duro, sia in termini di scarti, quindi di biomasse lignocellulosiche, sia in termini di produttività. La valorizzazione degli scarti è garantita da una caratterizzazione biochimica della fibra componente la biomassa lignocellulosica per individuare i genotipi che più si prestano alla conversione in bioetanolo; la produttività è valutata in risposta a stress idrico, utilizzando una piattaforma di fenotipizzazione, per individuare genotipi più tolleranti agli stress idrici, sempre più frequenti in questo scenario in cui i cambiamenti climatici hanno preso il sopravvento.

Ho lavorato come assegnista di ricerca fino al 2020. Conosciamo bene le storie di precariato della ricerca italiana, dopo dieci anni tra dottorato e assegni di ricerca post-doc, senti il bisogno di avere nuovi obbiettivi, di vedere un orizzonte più delineato e ti trovi a fare una scelta tra “passione e sopravvivenza”.

Dal 2020 ho iniziato un nuovo percorso come analista al controllo qualità microbiologico in un’azienda farmaceutica. Un mondo a parte rispetto al mondo della ricerca, più vicino alla realtà, mi sentirei di dire, la fase ultima della ricerca applicata. Capisci che sei di fronte ad un’opportunità che devi sfruttare e che ti permetterà sicuramente di ampliare il tuo background di conoscenze e competenze, ma soprattutto di ridisegnare la tua vita lavorativa e non.

Inoltre, guardando il bicchiere sempre “mezzo pieno”, con una nota positiva, posso dire che, questo nuovo lavoro, o meglio, la sicurezza di un vero lavoro, mi ha dato lo stimolo e la tranquillità per continuare a coltivare la mia più grande passione in serenità, a differenza di quanto si può fare quando sei in bilico tra una scadenza di un contratto e la speranza di un rinnovo.

Con Ivana abbiamo dal 2015 iniziato questo studio volto alla caratterizzazione delle biomasse lignocellulosiche di scarto, essenzialmente utilizzando paglie di frumento.

Con il temine biomassa si intende generalmente, qualsiasi sostanza di matrice organica, vegetale o animale. I prodotti di biomassa comprendono sostanze molteplici. Residui di origine forestale, agricola o zootecnica, rifiuti di origine urbana, prodotti di scarto di industrie agro-alimentari, alghe o altre specie vegetali. L’energia contenuta nelle biomasse lignocellulosiche non è altro che energia solare raccolta tramite i processi di fotosintesi, grazie ai quali anidride carbonica ed acqua vengono trasformate in materiale organico sfruttabile.

Il 90% delle biomasse è di origine vegetale, solo il 10% è rappresentato da biomasse di origine animale. L’interesse per le biomasse come fonte energetica è dovuta al fatto che tale energia viene ottenuta mediante lo sfruttamento di sostanze che, a differenza dei combustibili fossili, sono rinnovabili. Per cui il loro sfruttamento non implica riduzione della loro entità. È noto, inoltre, come l’utilizzo delle biomasse lignocellulosiche per fini energetici non contribuisce ad intensificare l’effetto serra, poiché la quantità di anidride carbonica rilasciata durante la decomposizione è equivalente a quella assorbita durante la crescita della biomassa stessa.

Non vi è quindi alcun aumento netto del livello di CO2 nell’atmosfera. Sostanzialmente i tre principali campi di applicazione delle biomasse riguardano: la produzione di energia elettrica e termica (biopower), l’utilizzo di biomasse per la produzione di composti chimici (bioproducts), che forniscono un contributo nell’industria come materiali per l’edilizia, lubrificanti, solventi, fertilizzanti ed infine, l’applicazione delle biomasse per la produzione di biocarburanti (biofuels) impiegati nei mezzi di trasporto.

In particolare, quando si parla di biocarburanti, si parla in termini di generazioni. Quelli di prima generazione, come mais, soia, olio di palma e canna da zucchero, utilizzano colture alimentari come materia prima e fonti di zuccheri. I problemi legati all’utilizzo di biocarburanti di prima generazione sono da attribuire all’utilizzo di terreni dedicati che vengono quindi sottratti all’impiego per scopi alimentari, con conseguente aumento dei prezzi di tali prodotti. I biocarburanti di seconda generazione, utilizzano le biomasse lignocellulosiche come fonte di zuccheri, quindi scarti agricoli che non competono con le colture destinate al consumo alimentare. La terza generazione di biocarburanti cerca invece di migliorare la qualità delle materie prime, progettando quindi colture in grado di aumentare la resa in zuccheri. Sono stati creati alberi di pioppo, con bassi contenuti di lignina, con biomasse quindi meno recalcitranti.

Nel nostro studio ci siamo quindi focalizzate sui biocarburanti di seconda generazione, la cui fonte di zuccheri è rappresentata dalla parete cellulare vegetale. Rispetto alle colture zuccherine e amidacee, le colture lignocellulosiche sono più abbondanti e questo rappresenta uno dei principali vantaggi nell’utilizzo di biomasse lignocellulosiche da valorizzare.

Le biomasse lignocellulosiche risultano principalmente costituite da: cellulosa, emicellulosa, pectine e lignina e gli zuccheri sono così saldamente legati all’interno del complesso della lignocellulosa da rendere la loro estrazione difficoltosa tanto da rappresentare un grande inconveniente in termini economici per l’industria. La produzione di biocombustibili mediante processo biochimico comporta la conversione della biomassa in zuccheri, in un processo noto come saccarificazione, che saranno successivamente fermentati.

La saccarificazione può essere effettuata mediante idrolisi acida, con l’utilizzo di acidi ad alte temperature, o idrolisi enzimatica, impiegando miscele enzimatiche per ottenere zuccheri fermentabili. Quest’ultima rappresenta la tecnologia più utilizzata data la sua alta efficienza. La presenza della lignina e di legami covalenti e ionici tra le altre componenti della parete cellulare, ostacola l’accesso degli enzimi idrolitici alla cellulosa ed emicellulosa e rende quindi la parete cellulare recalcitrante all’idrolisi enzimatica. Per ridurre la recalcitranza delle pareti cellulari all’idrolisi enzimatica sono necessari processi di pretrattamento che comportano la separazione fisica della cellulosa e dell’emicellulosa dalla lignina. Il tradizionale pretrattamento può essere chimico-fisico, chimico e meccanico. Il costo del pretrattamento può raggiungere fino al 40% del totale costo di gestione dell’intero processo e un effetto indesiderato del pretrattamento è la formazione di sottoprodotti che inibiscono l’attività fermentativa dei microrganismi utilizzati nei processi successivi.

In una prima fase di studio abbiamo selezionato alcune linee di frumento (Fig.2), per le quali sono state caratterizzate le pareti cellulari e successivamente l’efficienza di saccarificazione, senza effettuare un primo step di pretrattamento. Questo ci ha permesso di sfruttare la variabilità genetica di questa collezione per individuare linee meno recalcitranti e quindi più idonee ad una saccarificazione enzimatica.

Un campo di applicazione al quale stiamo dedicando la nostra ricerca, è l’impiego degli enzimi fungini nei processi di pretrattamento, il cosiddetto, pretrattamento biologico. Tale pretrattamento, utilizzando soprattutto laccasi fungine che degradano la lignina, renderebbe più efficiente l’accesso degli enzimi idrolitici alla cellulosa ed emicellulosa con conseguente liberazione di zuccheri dalla parete cellulare, il tutto si tradurrebbe in una conversione più vantaggiosa in termini economici e ambientali, quindi più sostenibile.”

Figura 2: Dott.ssa Donatella Danzi, rilievi in campo su linee di frumento da utilizzare per la valorizzazione degli scarti lignocellulosici.
Figura 2: Dott.ssa Donatella Danzi, rilievi in campo su linee di frumento da utilizzare per la valorizzazione degli scarti lignocellulosici.

Perché vi siete appassionate a questo settore e come due persone con background diverso hanno intrapreso un percorso in comune?

Dott.ssa Marino: “La valorizzazione di biomasse lignocellulosiche con la conversione in prodotti ad alto valore aggiunto che trovano applicazione in svariati campi, chimico, alimentare, farmaceutico, cosmetico, è tra le sfide più importanti della ricerca nel campo delle biotecnologie industriali. I funghi, grazie alle loro peculiari capacità metaboliche, sono in grado di trasformare le molecole più complesse e possono dunque essere validi protagonisti di un’economia circolare.”

Dott.ssa Danzi: “La combinazione delle nostre competenze ci permette di andare a fondo in questo settore. Nella nostra linea di ricerca abbiamo unito le competenze nell’ambito della fermentazione e produzione di enzimi fungini a quelle di conoscenza della parete cellulare. Ho iniziato a lavorare sulle pareti cellulari durante lo svolgimento della tesi di laurea. Quando si dice che Il primo amore non si scorda mai…, ed è proprio così, mi sono sempre ripromessa di tornare a lavorare sul settore, perché le pareti cellulari sono una fonte rinnovabile di risorsa, che meritano valorizzazione. E dal nostro incontro è nato tutto.”

Il vostro obbiettivo è quindi di rendere gli scarti in valore, perché è così importante oggi?

Dott.ssa Marino: “Perché uno degli obbiettivi globali moderni è la transizione energetica ossia il passaggio da un’economia lineare basata su risorse fossili a un’economia circolare basata sulla valorizzazione di risorse rinnovabili e sul riciclo degli scarti derivanti dai più importanti processi produttivi dell’uomo. L’emergenza ambientale rende necessario lo studio di sistemi alternativi per produrre energia e la ricerca di chemicals da scarti, che diventano così una risorsa, è una sfida che vogliamo portare avanti e che ci appassiona.”

Che fonti utilizzate?

Dott.ssa Danzi: “Utilizziamo prevalentemente paglia di frumento duro (Fig.3) che è di facile reperimento in zona. Questo tipo di scarto rappresenta un modello che si può poi applicare a qualunque altro tipo di biomassa. Le linee di frumento utilizzate per gli studi provengono da una collezione di circa 450 genotipi di frumento duro provenienti da diverse zone dell’area del bacino del Mediterraneo, creata presso l’IBBR CNR di Bari mediante metodo della discendenza da singolo seme  (Single Seed Descent, SSD), un approccio di miglioramento genetico per la selezione di linee pure”

Figura 3: Crescita del micelio fungino su paglia in fermentatore allo stato solido.
Figura 3: Crescita del micelio fungino su paglia in fermentatore allo stato solido.

Che risultati avete ottenuto e quali sono le vostre considerazioni?

Dott.ssa Danzi: “La scelta dei genotipi da testare in questo primo studio pilota è stata fatta sulla base di referenze bibliografiche secondo le quali piante a taglia maggiore risultano più saccarificabili e danno quindi maggior resa in seguito ad idrolisi enzimatica. Pertanto abbiamo selezionato linee a diversa taglia e le stesse sono state caratterizzate nelle componenti della parete cellulare e in termini di rilascio di zuccheri in seguito alla saccarificazione enzimatica. Il tutto è stato fatto senza alcun pretrattamento. Il nostro obbiettivo in questa prima fase è stato quello di cercare di studiare e capire se c’è diversità nella composizione della parete cellulare in una vasta variabilità genetica di linee di frumento provenienti da diverse aree geografiche.

Lo studio ha evidenziato come in effetti genotipi a minor contenuto di lignina e a taglia maggiore, risultano meno recalcitranti all’idrolisi enzimatica, ed hanno anche una buona resa in granella; quindi sono i migliori candidati all’impiego degli scarti per l’ottenimento di carburanti di seconda generazione. Grazie a queste caratteristiche non viene messo in discussione l’impiego efficiente dei terreni ai fini alimentari che è prioritario per soddisfare la richiesta mondiale di cibo. Sono in corso studi su questi genotipi promettenti, per delignificare la biomassa sia attraverso l’impiego diretto dei funghi ligninolitici (Fig.4) sia attraverso l’impiego dei loro enzimi parzialmente purificati. I risultati preliminari sono molto incoraggianti.”

Dott.ssa Marino: “Un altro studio riguarda invece l’impiego di enzimi come la laccasi, prodotta da questi funghi fermentati su scarti agricoli, come biocatalizzatore nelle reazioni di ossidazione ad esempio degli alcool in aldeidi. Questa rappresenta una via alternativa e molto più sostenibile dal punto di vista ambientale all’ossidazione catalitica, che richiede catalizzatori metallici che sono tossici e molto costosi. Abbiamo in corso anche studi rivolti alla ricerca di molecole bioattive dalle biomasse di scarto a seguito della fermentazione dei funghi ligninolitici.”

Figura 4: Sviluppo di miceli su piastre con terreno di crescita Potato dextrose agar.
Figura 4: Sviluppo di miceli su piastre con terreno di crescita Potato dextrose agar.

Vi ringraziamo per questa intervista e, se possibile un’ultima domanda: avreste intrapreso questo percorso di ricerca se aveste saputo le difficoltà che avreste incontrato?

Dott.ssa Marino: “Certamente Sì! Nella ricerca, in qualunque settore non c’è quasi mai la strada scorrevole. I risultati arrivano sempre dopo tanto lavoro. Noi crediamo che ci sia tantissimo ancora da esplorare nell’ambito dello sfruttamento delle biomasse lignocellulosiche attraverso l’azione dei funghi e vogliamo cogliere questa sfida che va molto nella direzione di ciò che adesso è richiesto a livello globale dalla ricerca nel settore delle biotecnologie. La ricerca di molecole naturali, di nuovi materiali completamente biodegradabili, di alternative al petrolio è sicuramente un target che vogliamo seguire per mettere a frutto anche diversi anni di esperienza e per realizzare qualcosa di concreto per aiutare il nostro pianeta sofferente.”

Dott.ssa Danzi: “Attualmente lavoro come analista, ma quando non lavoro in azienda, mi dedico alla mia passione più grande e alla ricerca bibliografica. La vita del ricercatore, soprattutto in Italia è dura. Ore e ore in laboratorio a trafficare con le provette e gli esperimenti e il fine settimana sui libri per gli aggiornamenti. Ogni idea viene prima messa in discussione, quindi criticata, affrontata e poi si cerca di confermarla in laboratorio. La ricerca non ha un tempo stabilito, tutto sta nell’imboccare la strada giusta, cosa non sempre semplice. Ma è proprio questo il bello della ricerca, nulla è più bello di una scoperta! Quindi sicuramente Sì! Avrei intrapreso questo percorso pur sapendo delle difficoltà incontrate, perché qualunque sia il percorso, se fatto con passione, dedizione e soprattutto con i giusti collaboratori, potrà essere affrontato”.

Il link ai nostri primi risultati pubblicati in collaborazione con l’Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari (ISPA-CNR) di Sassari, il Dipartimento di Chimica e Farmacia dell’Università di Sassari e l’ENEA Centro Ricerche Trisaia di Rotondella : https://www.mdpi.com/1996-1073/14/22/7735

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