Penicillium chrysogenum

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Caratteristiche

Il fungo filamentoso Penicillium chrysogenum (conosciuto in precedenza come Penicillium notatum) rappresenta il membro più studiato di una famiglia di più di 350 specie di Penicillium che costituiscono il genere. Si tratta del gruppo di miceti più famosi per essere la sorgente di vari antibiotici β-lattamici, di cui il più rappresentativo è la penicillina. Altri metaboliti secondari prodotti da P. chrysogenum sono la meleagrina (un alcaloide benzilisochinolinico), la crisogina (un pigmento), la roquefortina C (una micotossina), l’andrastatina A, la sorbicillina, gli acidi secalonici (un gruppo di tetraidroxantoni dimerici chirali), la fungisporina (un tetrapeptide idrofobico ciclico), e la 6-MSA YWA1/melanina.

Questo fungo è diffuso comunemente nelle regioni temperate e subtropicali, può essere trovato nel suolo e sulla vegetazione in putrefazione, ma può svilupparsi anche su cibi conservati, frutta, verdura, chicchi di cereali, margarina, formaggio e altri prodotti caseari che hanno la tendenza a decomporsi dopo un certo periodo di tempo. Ulteriori siti eccellenti per la crescita di questo fungo sono gli ambienti chiusi, soprattutto gli edifici assai umidi o danneggiati dall’acqua. Se degli articoli di pelletteria (come scarpe, giacche, cinture, divani) permangono per un lungo periodo in luoghi impregnati di umidità, possono diventare ospiti del micete.

Filogenesi

DominioEukaryota
RegnoFungi
PhylumAscomycota
SubphylumPezizomycotina
ClasseEurotiomycetes
OrdineEurotiales
FamigliaTrichomaceae
GenerePenicillium
SpeciePenicillium chrysogenum

Morfologia e riproduzione

Come molte altre specie del genere Penicillium, Penicillium chrysogenum si riproduce generando catene di spore (conidi) a partire da conidiofori ramificati a forma di pennello (Fig. 1). I conidi sono tipicamente trasportati dalle correnti d’aria a nuovi siti di colonizzazione. Penicillium chrysogenum presenta dei conidi bluastri o blu-verdastri, e qualche volta la muffa emana un pigmento giallo, la crisogina, che forma un alone (Fig. 2). Questo metabolita è stato isolato nel 1973 ed è sintetizzato grazie all’enzima peptide sintetasi non ribosomiale (NRPS), codificato dal gene chyA. Tale enzima media la condensazione dell’acido antranilico e dell’alanina nell’intermedio acido 2-(2-aminopropanamido) benzoico.

Tuttavia, l’identificazione di Penicillium chrysogenum non si può basare sul colore dell’alone, bensì le osservazioni delle caratteristiche morfologiche e microscopiche sono necessarie per confermare l’identità, e il sequenzialmento del DNA è essenziale al fine di distinguerlo dalle specie strettamente correlate come il Penicillium rubens.

Penicillium chrysogenum comprende svariati aspetti morfologici quando cresce in colture sommerse, oscillando da ife omogeneamente disperse ad agglomerati compatti di ife conosciuti come pellet. Ogni classe morfologica influenza la vitalità, la produttività e la performance in diversi modi. Dal punto di vista del processo di controllo, i pellet sono favoriti nel momento in cui vengono facilitati il trasferimento di materia dai gas ai liquidi e la miscelazione. Tuttavia, questo tipo di morfologia può anche portare alla formazione di zone attive e non attive all’interno del pellet, e ciò è dovuto alle limitazioni nel trasporto di substrati e prodotti, specialmente l’ossigeno. Anche questi siti influiscono anche sulla produttività, ad esempio la sintesi di penicillina avviene nel citoplasma non crescente trovato nello strato esterno del pellet. A sua volta, il cuore del pellet esibisce la degradazione delle ife, un declino nella vitalità e nessuna produttività.

Rappresentazione schematica e fotografia al microscopio elettronico a scansione della struttura di P. chrysogenum costituita da conidiofori, metulae e conidi
Figura 1 – Rappresentazione schematica e fotografia al microscopio elettronico a scansione della struttura di P. chrysogenum costituita da conidiofori, metulae e conidi
Figura 2 – Aspetto delle colonie di P. chrysogenum
Figura 2 – Aspetto delle colonie di P. chrysogenum

Malgrado Penicillium chrysogenum sia noto per la riproduzione asessuata, la raccolta di varie evidenze ha suggerito che questo micete sia potenzialmente capace di riprodursi sessualmente con uno stadio sessuale “criptico”. Nel 2013 Julia Böhm e collaboratori scoprirono i geni del tipo di accoppiamento (MAT) e i geni di segnalazione dei feromoni in Penicillium chrysogenum, coinvolti nell’accoppiamento in altri funghi che si riproducono in maniera sessuata. Negli ascomiceti questi geni codificano per fattori di trascrizione che regolano sia gli stadi precoci che gli stadi tardivi del ciclo sessuato. Gli ascomiceti eterotallici rilasciano gameti che presentano un singolo gene MAT, e la fecondazione si verifica solo tra gameti che portano geni di accoppiamento complementari, cioè MAT1-1 e MAT1-2. I ricercatori hanno eseguito l’accoppiamento dei ceppi Q176 (MAT1-1) e IB 08/921 (MAT1-2); le colture sono state lasciate al buio per cinque settimane su Oatmeal agar (terreno contenente farina d’avena come fonte di azoto, carbonio e proteine) supplementato con biotina, necessaria per il compimento del ciclo sessuato. Dopodiché i geni del tipo di accoppiamento (MAT1-1 o MAT1-2) dei ceppi sono stati determinati in seguito ad amplificazione tramite PCR. Da questo studio è emerso che il gene MAT1-1-1 regola la trascrizione di una vasta gamma di geni, compresi quelli che controllano la produzione di penicillina, la morfologia delle ife e la formazione dei conidi.

Identificazione

L’identificazione del Penicillium viene effettuata mediante la caratterizzazione macromorfologica, micromorfologica, biochimica e molecolare. Per quanto riguarda la macromorfologia, sono raccomandati il Czapek Yeast Autolysate agar (CYA) e il Malt Extract agar (MEA, Oxoid) come mezzi di coltura standard; per l’osservazione di caratteri tassonomici addizionali, si usano i seguenti terreni alternativi: Czapek’s agar (CZ), Yeast Extract Sucrose agar (YES), Oatmeal agar (OA, per la riproduzione sessuata), Creatine Sucrose agar (CREA, per la produzione di acidi), Dichloran 18 % Glycerol agar (DG18), Blakeslee’s MEA e CYA con il 5 % NaCl (CYAS).

Tutti i mezzi di coltura devono essere incubati alla temperatura di 25°C per 7 giorni, l’aggiunta di piastre di CYA a 30 e 37°C è utile per distinguere le specie. È cruciale che le temperature siano accuratamente controllate, in quanto piccole differenze possono avere un forte impatto sulla crescita delle colonie. Dopo 7 giorni, vengono misurati i diametri delle colonie nella parte più ampia di esse. Caratteri importanti per descrivere il Penicillium comprendono la superficie delle colonie, il grado di sporulazione, il colore dei conidi, l’abbondanza, l’aspetto e il colore del micelio, la presenza o l’assenza di pigmenti solubili ed essudati, il grado di crescita e il rilascio di acidi.

Nello studio della micromorfologia, i caratteri dei conidiofori hanno una notevole importanza tassonomica, e il pattern di ramificazione è tradizionalmente utilizzato per la classificazione del Penicillium (Fig. 3). L’aspetto dei conidiofori può oscillare da semplice (fialidi solitarie) a molto complesso con multipli livelli di ramificazione che nell’insieme formano sequenze simmetriche o asimmetriche. Ulteriori attributi sono dimensione, forma e trama degli steli, delle vescicole, delle metulae (quando presenti), delle fialidi, dei conidi, degli ascocarpi e delle ascospore (quando presenti).

Diversi tipi di conidiofori nelle specie di Penicillium. A) P. thornii; B) P. lanoso-caerulium; C) P. vermiculatum; D) P. glaucum; E) P. herquei; F) P. chrysogenum
Figura 3 – Diversi tipi di conidiofori nelle specie di Penicillium. A) P. thornii; B) P. lanoso-caerulium; C) P. vermiculatum; D) P. glaucum; E) P. herquei; F) P. chrysogenum

L’analisi molecolare consiste nell’esecuzione del sequenziamento genomico, allo scopo di distinguere specifici geni utili per l’identificazione; tra questi abbiamo il gene BenA, che codifica per la β-tubulina, CamA, codificante per la calmodulina, e RPB2, codificante per la seconda subunità dell’RNA polimerasi II. BenA può essere usato con successo per l’identificazione accurata delle specie di Penicillium. CamA consente di discernere P. chrysogenum da P. allii-sativi, ma non discrimina P. chrysogenum e P. rubens.

Una volta ottenute le sequenze, si procede con l’analisi bioinformatica mediante allo scopo di comprarle con le sequenze contenute nel database.

Infine, abbiamo l’analisi biochimica, che si basa sull’individuazione di specifici metaboliti (nel caso del P. chrysogenum, quello più indicativo è la crisogina); i mezzi di coltura impiegati sono soprattutto CYA agar e YES agar, ottimi per favorire la produzione della maggior parte dei metaboliti diagnostici dopo incubazione di 7 giorni a 25°C al buio.

Patogenesi

In genere i funghi del genere Penicillium sono considerati dei microorganismi sicuri. Ciononostante P. chrysogenum è responsabile di varie infezioni opportunistiche. A parte le condizioni relativamente benigne come rash cutanei e infezioni dell’orecchio, questo fungo provoca sinusiti, endoftalmiti postraumatiche, esofagiti necrotizzanti in pazienti con AIDS, polmonite necrotizzante, invasione intestinale e malattie disseminate.

Un caso di infezione disseminata causata da P. chrysogenum è stata riferita in un bambino di 10 anni con una storia di glomerulonefrite proliferativa e porpora di Schönlein-Henoch (o porpora anafilattoide), trattato con farmaci immunosoppressori. Il paziente aveva un quadro clinico di 2 settimane di febbre che non rispondeva al trattamento con antibiotici ad ampio spettro e all’amfotericina B. L’esame con tomografia computerizzata mostrò un infiltrato diffuso simile al cotone nei polmoni, epatomegalia, linfadenopatia mesenterica, e multiple lesioni circolari ipodense nella milza. Il trattamento fu cambiato a caspofungina, seguita da variconazolo. Un mese dopo, la biopsia splenica rivelò ife settate ialine di diametro maggiore di 1 μm. La crescita fungina risultò negativa, ma l’analisi molecolare rivelò il 99% di identità con P. chrysogenum. Venne eseguita una splenectomia terapeutica, e il trattamento fu cambiato ad amfotericina B liposomiale e caspofungina. Il ragazzo completò due mesi di terapia che portò alla risoluzione dell’infezione.

Sono stati documentati anche dei casi isolati senza una chiara immunosoppressione, per esempio quello di una donna afro-americana di 51 anni che lamentava dolore addominale, nausea e vomito; la tomografia computerizzata rivelò aria extraluminale intraperitoneale, e la paziente venne portata in sala operatoria. La laparotomia esplorativa individuò la presenza di ernia peristomale con perforazione dell’intestino tenue. Furono quindi eseguite la riparazione dell’ernia e la resezione dell’intestino tenue. La fase postoperatoria si complicò a causa di una sepsi severa con insufficienza respiratoria, ipotensione, leucocitosi e coagulazione intravascolare disseminata. La donna fu trattata con idrocortisone e sviluppò un’iperglicemia indotta da steroidi. Al terzo giorno postoperatorio fu piazzato un dispositivo VAC (vacuum assisted closure) per aiutare la guarigione fasciale. La sepsi si risolse e le condizioni della paziente migliorarono fino al nono giorno postoperatorio, quando si notò che le feci si accumulavano all’interno del sistema VAC. La donna venne riportata in sala operatoria, dove si scoprì che aveva un’interruzione anastomotica. La biopsia prelevata nella seconda operazione chirurgica svelò una necrosi ischemica transmurale con invasione vascolare da parte di un organismo fungino (Fig. 4A). La coltura di un campione di sangue risultò positiva al P. chrysogenum (Fig. 4B) e la paziente completò una terapia di sei settimane con amfotericina B liposomiale, seguita da somministrazione orale di itraconazolo. In seguito fu dimessa senza alcuna evidenza di infezione ricorrente.

A) Biopsia della mucosa dell’intestino tenue che mostra l’angioinvasione; B) Aspetto del Penicillium risultante dalla coltura del campione ematico
Figura 4 – A) Biopsia della mucosa dell’intestino tenue che mostra l’angioinvasione; B) Aspetto del Penicillium risultante dalla coltura del campione ematico

Diagnosi e terapia

La difficoltà primaria nella diagnostica delle infezione da Penicillium, dovuta alla sua rarità, è un basso sospetto clinico. Questo dovrebbe essere considerato nella situazione di immunocompromissione o dopo una terapia antibiotica appropriata che non porta ad alcuna risoluzione dei sintomi. Non esistono chiari indicatori dall’anamnesi o dall’esame fisico che siano specifici per l’infezione da Penicillium, che può essere causa di un ampio spettro di malattie.

Fortunatamente il Penicillium cresce rapidamente sui mezzi di coltura fungini ordinari, e può essere identificato nel corso di un normale controllo completo. Risultati da una biopsia, o dall’operazione chirurgica di una patologia, possono essere di aiuto quando sono disponibili. Tuttavia, bisogna considerare che le colture positive da sorgenti respiratorie possono non essere associate con la patologia invasiva, ma piuttosto con la colonizzazione. La prognosi rimane alquanto negativa, tuttavia è essenziale il trattamento aggressivo, compreso lo sbrigliamento chirurgico e la rimozioni del foci di infezione insieme all’utilizzo di amfotericina B.

Multipli agenti antifungini sono stati impiegati con vari periodi di trattamento per le infezioni da Penicillium. La terapia con amfotericina B e itraconazolo ha dato risultati misti, in parte a causa della varietà dei siti di infezione e della comorbidità. È stata applicata anche la terapia combinatoria con i suddetti agenti antifungini (incluso il ketoconazolo) o la flucitosina, che ha restituito dei risultati variabili.

Allergie

Le spore asessuate generate dal P. chrysogenum rappresentano importanti allergeni umani. Le serina proteasi alcaline e vacuolari si comportano come le maggiori proteine allergeniche. Le spore vengono rilasciate nel momento in cui la colonia giunge a maturazione, esse sono ubiquitarie nell’aria intorno a noi e vengono inalate in gran numero e giornalmente. Nonostante su molta gente non abbiano alcun effetto, ci sono individui sensibili che possono sviluppare reazioni avverse, ovvero potrebbero soffrite di problemi respiratori, allergie cutanee, starnuti continui, occhi rossi e umidi. Se il fungo si sviluppa nelle nostre vicinanze, la concentrazione delle spore nell’aria aumenta, come anche la probabilità di danno alla nostra salute.

Un’altra tipologia di allergia correlata al P. chrysogenum è ovviamente la ben documentata allergia alla penicillina che avviene in alcuni individui. Anche se approssimativamente il 10% delle persone è classificato come allergico alla penicillina, una cospicua percentuale di essi risulta in realtà negativa al test allergenico e riesce a tollerare tale antibiotico. Persino coloro che sono allergici saranno desensibilizzati in un periodo di circa 10 anni. L’allergia alla penicillina viene diagnosticata spesso durante l’infanzia, periodo in cui le infezioni pediatriche comuni possono contribuire o essere confuse con l’allergia. Comunque, le reazioni allergiche si possono verificare in persone che hanno preso questo antibiotico senza problemi; i sintomi comuni includono nausea, vomito, diarrea, rash e gonfiore della faccia o delle estremità. In casi rari possono sopraggiungere gravi reazioni anafilattiche con gonfiore di lingua, gola e labbra, insieme a sintomi respiratori e perdita di coscienza.

Fonti

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