Marine Agar

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Utilizzo

Marine Agar (2216) è un terreno impiegato per l’isolamento, la coltivazione ed il mantenimento di una vasta varietà di batteri marini eterotrofi. Esso trova inoltre applicazione nelle metodiche di controllo dell’industria alimentare o negli studi di conservazione della vita marina.

I batteri marini infatti sono presenti nell’acque dei mari in milioni per ogni mL di acqua. Sono essenziali per il ciclo vitale della flora e la fauna marina. E’ di particolare importanza utilizzare un terreno specifico poiché i mari presentano acque ricche di nutrienti con una specifica composizione.

Principio di funzionamento

L’obiettivo della particolare composizione di questo terreno di coltura è di ricreare fedelmente l’ambiente marino. Essendo quest’ultimo un ambiente molto ricco dal punto di vista nutrizionale, il terreno è ricco di minerali. I peptoni vengono aggiunti insieme ad estratti di lieviti per garantire una giusta fonte di nutrienti, in particolar modo nitrogeno e vitamine. L’agar rappresenta l’agente solidificante.

Composizione del terreno

Il terreno Marine Agar 2216 è così composto:

  • Peptoni 5.0 g/L
  • Estratti di lievito 1.0 g/L
  • Citrato ferrico 0.1 g/L
  • Cloruro di sodio 19.45 g/L
  • Cloruro di magnesio 8.8 g/L
  • Solfato di sodio 3.24 g/L
  • Cloruro di calcio 1.8 g/L
  • Cloruro di potassio 0.55 g/L
  • Bicarbonato di sodio 0.16 g/L
  • Bromuro di potassio 0.08 g/L
  • Cloruro di stronzio 34.0 mg/L
  • Acido borico 22.0 mg/L
  • Silicato di sodio 4.0 mg/L
  • Fluoruro di sodio 2.4 mg/L
  • Nitrato di ammonio 1.6 mg/L
  • Bifosfato di sodio 8.0 mg/L
  • Agar 15.0 g/L

Il pH finale del terreno è pari a 7.2, tra i 20-25 °C.
Esso è preparato seguendo la formula originale proposta da Zobell, contiene quindi tutti i nutrienti necessari alla crescita di tipici batteri marini.

Aspetto del terreno

Il Marine Agar (2216) si presenta in forma polverosa (prima dell’utilizzo), di colore beige con piccole e poche particelle di colore scuro e omogeneo. In soluzione (al 5,51%) si presenta con un colore ambrato chiaro, da leggermente opalescente a opalescente con leggero precipitato.

Preparazione del terreno

  • Sospendere 55.1 g di terreno in 1 L di acqua purificata; in secondo luogo mescolare per bene la soluzione.
  • Agitare la soluzione frequentemente riscaldandola e portare ad ebollizione successivamente per 1 minuto per dissolvere completamente il preparato.
  • Autoclavare a 121° per 15 minuti.
  • Testare un campione del prodotto finale usando colture di controllo tipiche e stabili.

Risultati della crescita

Per l’utilizzo di questo terreno vengono utilizzate le normali tecniche di diffusione o versamento su piastra. Per il versamento, l’agar deve essere raffreddato a 42°C, prima dell’inoculazione a causa della natura termo-sensibile della maggior parte dei batteri marini.
Nella tecniche di diffusione, l’agar è versato caldo e viene lasciato raffreddare e solidificare prima dell’inoculazione. Quest’ultimo metodo è stato introdotto da Buck e Cleverdon per ottenere conteggi più elevati e precisi, rimediando al limite posto dalla natura termo-sensibile dei batteri. E’ altamente consigliato inoltre preferire tecniche di striscio per l’inoculazione per evitare danni ai batteri da inserire sul terreno, da effettuare con un’ansa sterilizzata.

Sizemore e Stevenson, hanno inoltre utilizzato questo tipo di terreno, come strato nutriente superiore in una piastra a doppio strato composta da Marine Agar e Milk Agar. Questo tipo di terreno può essere quindi utilizzato in aggiunta per individuare e isolare batteri marini proteolitici, in grado di degradare anche componenti dell’agar.

BatteriCrescita
Escherichia coli ATCC 25922Buona
Vibrio parahemolyticus ATCC 17802Produttività > 0.70
Vibrio alginolyticus ATCC 17749Produttività > 0.70
Vibrio fischeri ATCC 7744Buona
Vibrio harveyi ATCC 14126Buona

In aggiunta il Marine Agar 2216 viene utilizzato per studiare la composizione dei batteri associati alla specie Crassostrea virginica (definita anche ostrica orientale).

Immagini

Marine agar kitoccocus sedentarius
Figura 1- Kitococcus sedentarius su Marine Agar. [Fonte: wikimedia.org]
escherichia coli marine agar 2216
Figura 2 – Escherichia coli su Marine Agar.[Fonte:scharlabmagyarorszag.hu]
vibrio harvey
Figura 3 – Vibrio harveyi su Marine Agar. [Fonte: Zhang et al., 2020]
Batteri lipolitici marine
Figura 4 – Marine Agar utilizzato per individuare batteri lipolitici. L’alone attorno alla colonia è indicativo dell’idrolisi del substrato. [Fonte: Scholante Delabary et al., 2020]

Conservazione del terreno

E’ un terreno utilizzabile solo in laboratorio. Per una corretta conservazione, occorre in primo luogo tenere il contenitore ben chiuso, al riparo dalla luce intensa, in un luogo fresco e asciutto (+4°C e 8°C, con una percentuale di umidità relativa inferiore al 60%). E’ importante rispettare le giuste condizioni di conservazione, poiché il terreno in questione presenta un elevato grado di igroscopicità.

Limitazioni del terreno

Nei processi di inoculo bisogna inoltre tener conto della possibile sensibilità dei diversi ceppi batterici in analisi alle elevate temperature, poiché molti batteri marini sono appunto termo-sensibili.

Fonti

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