Geni reporter

I geni reporter sono geni che consentono di indagare i meccanismi di espressione genica. Essi sono fusi con sequenze regolatorie o con geni di interesse, per segnalare la posizione o i livelli di espressione genica. I sistemi reporter includono geni che codificano per proteine fluorescenti ed enzimi che convertono dei substrati in composti luminescenti o colorati. In questo modo, le proteine reporter risultano essere facilmente distinguibili dalle proteine endogene sintetizzate dalla cellula.

Cosa sono i geni reporter?

Molti fenomeni fisiologici, tra cui la comunicazione cellulare e la regolazione della crescita cellulare, dipendono dall’espressione genica differenziale, che a sua volta dipende da programmi di sviluppo intrinseci della cellula e da segnali estrinseci. Per ottenere informazioni approfondite sulle vie di modulazione della trascrizione genica, è possibile utilizzare dei geni reporter controllati da sequenze regolatorie o promotori. Il gene reporter e il promotore si inseriscono in un vettore ricombinante designato ad hoc, introdotto nelle cellule per trasfezione. In seguito, si testano le cellule per verificare la presenza e l’attività del gene reporter, analizzando direttamente la quantità di mRNA del reporter, le proteine prodotte con la traduzione dell’mRNA del reporter o l’attività enzimatica di tali proteine (Fig.1).

Drosophila melanogaster
Figura 1 – Localizzazione di una proteina reporter prodotta in seguito all’espressione di un gene necessario per la barriera ematoencefalica di Drosophila melanogaster. Le aree con forte espressione genica sono in giallo, mentre l’espressione più debole è mostrata in rosso e in blu. Dopo la colorazione mediante immunoistochimica, l’immagine è stata acquista utilizzando un microscopio confocale [Fonte: Wikipedia]

Caratteristiche e scelta dei sistemi reporter

In linea di massima, un gene reporter:

  1. deve essere assente dalle cellule utilizzate nello studio o deve essere distinguibile dalla forma nativa del gene;
  2. deve avere un’elevata sensibilità ai segnali oggetto di indagine presenti nella cellula;
  3. deve fornire una risposta rapida e facilmente rilevabile in un ampio intervallo lineare;
  4. non deve influire sulla normale fisiologia e sulla salute generale delle cellule trasfettate.

Attualmente i geni reporter sono utilizzati in diversi studi in vitro e in vivo. La scelta di un gene reporter dipende dalla linea cellulare utilizzata, dalla natura dell’esperimento e dall’adattabilità del saggio ai metodi di rilevazione disponibili, ad esempio attraverso microscopia a fluorescenza.

Il promotore del gene reporter può essere costitutivo oppure inducibile. Se è costitutivo significa che la trascrizione del gene reporter è sempre attiva nella cellula. I promotori costitutivi sono essenziali soprattutto in saggi che hanno l’obiettivo di tracciare la localizzazione delle cellule. Un promotore inducibile è attivato solo in presenza di fattori di trascrizione specifici, agendo così da “sensore” endogeno. I promotori inducibili trovano ampia applicazione negli studi sulla regolazione spazio-temporale dei processi biologici.

Introduzione dei sistemi reporter nelle cellule

La definizione del protocollo di trasfezione è un ulteriore fattore da considerare.

La trasfezione comporta l’introduzione di molecole cariche negativamente, come il DNA, in cellule con una membrana carica negativamente. Sostanze chimiche come il fosfato di calcio e il dietilaminoetil (DEAE)-destrano o reagenti cationici a base di lipidi sono addizionati per rivestire il DNA (ad esempio il vettore ricombinante), neutralizzando o addirittura conferendo una carica positiva complessiva alla molecola. Come risultato, questo processo facilita l’attraversamento della membrana cellulare da parte del complesso DNA:reagente di trasfezione.

I metodi fisici come la microiniezione o l’elettroporazione perforano la membrana cellulare e introducono il DNA direttamente nel citoplasma. Indipendentemente dal metodo di trasfezione seguito, l’efficienza di trasfezione ottenuta varia a seconda del tipo di cellula da trasfettare e delle condizioni di trasfezione utilizzate.

Cellule HEK 293 trasfettate Geni reporter
Figura 2 – Risultato della trasfezione di cellule HEK 293 in coltura con il sensore di calcio neuronale marcato con fluorescenza, l’ippocalcina (HPCA-mTFP1, colore blu diffuso all’interno della cellula) e la proteina fluorescente gialla associata alla membrana (EYFP-Mem, colore giallo ai bordi della cellula). Immagina acquisita mediante microscopio confocale [Fonte: Wikipedia]

Tipi principali di sistemi reporter

La β-galattosidasi, le proteine fluorescenti e le luciferasi sono fra le principali proteine tradotte da geni reporter.

β-galattosidasi

Il gene lacZ di Escherichia coli può essere utilizzato come gene reporter sotto il controllo di un determinato promotore in una cassetta di espressione transgenica. Il gene lacZ codifica la β-galattosidasi, un enzima che in E.coli catalizza la scissione del lattosio in galattosio e glucosio. L’attività della β-galattosidasi è tracciabile con tecniche in situ e in vitro dopo l’incubazione con il substrato X-gal. La β-galattosidasi scinde l’X-gal, un substrato cromogenico, producendo galattosio e 5-bromo-4-cloro-3-idrossindolo, un composto che in presenza di ossigeno dimerizza e forma un colorante blu insolubile, consentendo così l’identificazione delle cellule con attività lacZ.

Per poter evidenziare l’attività della β-galattosidasi, il campione deve quindi essere prima colorato con una soluzione contenente l’X-gal, procedura non compatibile con campioni viventi. Il saggio lacZ/X-gal è indicato per indagare l’espressione genica in sezioni tissutali o embrioni interi.

Sistema lacZ Geni reporter
Figura 3 – Schema di azione del sistema reporter lacZ/X-gal [Fonte: rielaborazione da Wikipedia]

Proteine fluorescenti

La proteina GFP (Green fluorescent protein) è prodotta naturalmente dalla medusa Aequorea victoria. La GFP contiene un fluoroforo che, se colpito con fotoni di una certa lunghezza d’onda (395 nm e 475 nm), emette luce verde con un picco di emissione a circa 508 nm. La mutagenesi e l’ingegnerizzazione del gene GFP hanno portato allo sviluppo di altre varianti di GFP, tra cui BFP (Blue fluorescent protien), YPF (Yellow fluorescent protein) e CFP (Cyan fluorescent protein), che si differenziano per le diverse caratteristiche di assorbimento ed emissione. Il vantaggio considerevole delle proteine fluorescenti rispetto al sistema lacZ/X-gal consiste nell’indipendenza da substrati enzimatici, elemento che le ha rese ideali per rilevare l’espressione genica in vivo.

Lo sviluppo di nuove varianti di GFP è stato orientato negli ultimi anni ad aumentare la capacità di amplificazione del segnale generato dalla GFP. E’ stato stimato infatti che sia necessario raggiungere la concentrazione di 1 μM di GFP wild-type per eguagliare l’autofluorescenza endogena di una cellula di mammifero.

A riguardo, degli studi hanno dimostrato che se le molecole di GFP sono concentrate e localizzate in specifici compartimenti subcellulari, il rilevamento mediante microscopia ad alta risoluzione acquisisce maggiore efficienza. Ad esempio, il gene che codifica la GFP può essere fuso in-frame con il gene che codifica la proteina endogena. La proteina così originata è definita “proteina chimerica” ed è tradotta nella cellula o nell’organismo di interesse, mantenendo la funzione e la localizzazione della proteina di interesse, oltre alla fluorescenza.

Topi NOD/SCID che esprimono eGFP
Figura 4 – Due topi NOD/SCID che esprimono la GFP potenziata (eGFP) sotto illuminazione UV, affiancati da un topo NOD/SCID normale della linea parentale non transgenica [Fonte: Wikipedia]

Luciferasi

Le luciferasi sono proteine in grado di generare composti luminescenti e sono classificate in batteriche o eucariotiche a seconda della loro origine. Il gene luc, che codifica per la luciferasi di lucciola (Photinus pyralis), è stato ampiamente utilizzato grazie all’elevata sensibilità, alla correlazione lineare tra la concentrazione della proteina Luc e al segnale bioluminescente, all’assenza di modifiche post-traduzione della proteina Luc e all’inizio immediato dell’attività di Luc subito dopo la traduzione. In modo simile al sistema lacZ/X-gal, sono richiesti i substrati D-luciferina, ossigeno e ATP per l’emissione di luce nell’intervallo 530-640 nm (luce da blu a giallo-verde). La luciferasi Rluc, presente nel corallo Renilla reformis, non richiede invece ATP e ossida il substrato celenterazina, emettendo luce blu con un picco a 480 nm. Un’altra limitazione del sistema reporter della luciferasi è che il saggio manca tipicamente di una risoluzione a livello di singola cellula.

I sistemi reporter basati sulla luciferasi sono stati utilizzati per il rilevamento di cellule tumorali, la valutazione della crescita tumorale e il traffico di linfociti in vivo. Le luciferasi batteriche sono state applicate con successo nell’imaging dell’infezione batterica di cellule umane.

Fonti

Crediti immagini

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