Test di Ames

Condividi l'articolo di Microbiologia Italia:

Il test di Ames è un saggio che si impiega allo scopo di analizzare la capacità di una determinata sostanza di provocare danni al DNA (genotossicità). Gli ambiti in cui viene maggiormente utilizzato sono i seguenti:

  • La fase preclinica di sperimentazione di nuove molecole;
  • L’analisi dei prodotti cosmetici;
  • Il controllo delle sostanze chimiche usate per la creazione dei farmaci;
  • Le analisi ambientali.

Questo tipo di esame fu introdotto nel 1973 dal biochimico americano Bruce Nathan Ames, il quale, mentre leggeva gli ingredienti sulla confezione di patatine che stava mangiando, si chiese se quei composti aventi un nome difficile fossero in grado di causare mutazioni nei ceppi di Salmonella che egli stava studiando in quel periodo. Ebbe quindi l’idea di creare un’analisi il cui obiettivo era quello di stabilire la mutagenicità di una sostanza, adoperando dei ceppi mutanti dei batteri oggetto delle sue ricerche.

Principio

Il saggio si fonda sulla misurazione dell’abilità di microorganismi auxotrofi (ovvero incapaci di sintetizzare un prodotto essenziale per la loro sopravvivenza) di indurre la reversione di una mutazione e permettere loro di riacquisire la capacità di crescere in un ambiente privo di quella sostanza vitale. Normalmente si impiegano ceppi di Salmonella thyphimurium che presentano un deficit nella via biosintetica dell’amminoacido istidina (His) e ceppi di Escherichia Coli che non riescono a produrre l’amminoacido triptofano (Trp). Tali ceppi batterici mutanti vengono concepiti provocando delle mutazioni puntiformi (missenso, non senso, frame-shift) nell’operone dell’istidina e nell’operone del triptofano; in questo modo i batteri risultano incapaci di proliferare in terreni privi di quell’amminoacido.

Nel momento in cui una specifica sostanza induce una mutazione, i batteri mutanti sono di nuovo capaci di produrre quell’amminoacido e quindi di proliferare in un terreno che non lo contiene; da auxotrofi diventano prototrofi. C’è da sottolineare che i ceppi di Salmonella ed E. coli adoperati nel saggio di solito sono caratterizzati da mutazioni che modificano la permeabilità della membrana, per esempio la mutazioni del locus Rfa (chiamato anche Waa), nel quale sono presenti tre operoni implicati nella sintesi dei lipopolisaccaridi (LPS) di membrana (Fig. 1). Ciò comporta una troncamento marcato della catena dei LPS e permette ai mutageni di grosse dimensioni di penetrare nella cellula batterica.

Raffigurazione schematica degli operoni Rfa nell’E. Coli (A) e della struttura dei LPS in seguito a mutazioni (B) [Christophe Pagnout et al., 2019]
Figura 1 – Raffigurazione schematica degli operoni Rfa nell’E. Coli (A) e della struttura dei LPS in seguito a mutazioni (B) [Christophe Pagnout et al., 2019]

In alternativa, vengono indotte alterazioni nei geni codificanti per le proteine coinvolte nella riparazione del DNA (MutS, MutL e MutH per la sistemazione degli errori di appaiamento, UvrABC per la riparazione per escissione di nucleotidi), al fine di garantire il mantenimento delle mutazioni ottenute per lo scopo del test. Tuttavia, l’abbattimento dei meccanismi di riparo ha come conseguenza la limitazione della crescita dei batteri, e per tale ragione si inserisce nel ceppo il plasmide pKM101, che include i geni del sistema di riparazione SOS del DNA (SulA, UmuD, UmuC), che corregge gli errori causati dalla trascrizione, e attua interrompendo la divisione cellulare e la replicazione del DNA.

In alcuni ceppi è presente anche la delezione di un gene implicato nella sintesi della biotina, che impedisce la sopravvivenza dei batteri in terreni in cui tale vitamina non è presente; l’utilità di questa ulteriore mutazione è legata alla possibilità di individuare contaminazioni del risultato finale, ovvero i batteri che hanno subito la retromutazione dovranno essere auxotrofi per la biotina.

Metodo e risultati attesi

Il test di Ames parte del presupposto che la struttura del DNA è uguale in ogni organismo vivente, perciò è possibile impiegare i batteri per individuare rapidamente dei mutageni, senza la necessità di attendere mesi o anni quando si usano i mammiferi come cavie. Nel caso di un topo, che è l’organismo modello adoperato in maggior misura, il ciclo vitale dura due o tre anni, invece nei batteri la genesi di una sola generazione richiede circa venti minuti.

La realizzazione dell’esame inizia seminando i batteri su una piastra di terreno solido di agar che comprende una piccola quantità di istidina o di triptofano; questa serve per permettere la formazione delle colonie iniziali, dunque per favorire la creazione di mutanti, e per svelare le mutazioni che necessitano di più cicli di riproduzione cellulare prima di manifestarsi a livello fenotipico (per esempio le mutazioni puntiformi). In seguito al centro del terreno di coltura si colloca un disco di carta da filtro contenente la sostanza oggetto d’esame (campione), che si diffonde nel terreno generando così un gradiente di concentrazione.

Trascorso un lasso di tempo di 48 ore di incubazione a 37 °C, si espleta la valutazione della frequenza delle mutazioni in base alla distanza dal disco, in concomitanza con un terreno di controllo dove vengono coltivati batteri senza mettere il composto potenzialmente mutageno; il confronto tra le due piastre è fondamentale per eliminare dal risultato l’effetto causato da batteri in cui si verifica una reversione spontanea della mutazione. Nelle aree più limitrofe al disco, la concentrazione della sostanza è talmente alta da essere letale, quindi le colonie non si formano. Mano mano che si procede verso le zone più distanti, il mutageno si diluisce e raggiunge delle concentrazioni non letali che facilitano la retromutazione (Fig. 2).

Piastre di agar su cui sono stati seminati ceppi di Salmonella incapaci di sintetizzare l'istidina (his-). Nella piastra di controllo (sinistra), priva del campione, la crescita delle colonie è avvenuta in seguito a reversione spontanea della mutazione. Nella piastra oggetto d'esame (destra) si nota che nelle aree più vicine al disco le colonie non sono cresciute a causa dell'elevata concentrazione del mutageno, mentre nelle aree più lontane la concentrazione è più bassa e ha indotto la retromutazione; più si va verso i margini della piastra e più diminuiscono le colonie retromutate [https://www.mun.ca/biology/scarr/Bio4241_Ames_Test_1.html]
Figura 2 – Piastre di agar su cui sono stati seminati ceppi di Salmonella incapaci di sintetizzare l’istidina (his-). Nella piastra di controllo (sinistra), priva del campione, la crescita delle colonie è avvenuta in seguito a reversione spontanea della mutazione. Nella piastra oggetto d’esame (destra) si nota che nelle aree più vicine al disco le colonie non sono cresciute a causa dell’elevata concentrazione del mutageno, mentre nelle aree più lontane la concentrazione è più bassa e ha indotto la retromutazione; più si va verso i margini della piastra e più diminuiscono le colonie retromutate [https://www.mun.ca/biology/scarr/Bio4241_Ames_Test_1.html]

Alcune sostanze come l’aflatossina B1, il benzopirene, l’acetilaminofluorene e la benzidina non sono di per sé mutagene, bensì acquisiscono tale caratteristica solo dopo essere state metabolizzate. Per tale motivo alla coltura dei batteri viene aggiunto anche l’estratto di fegato di ratto S9, in cui gli enzimi microsomiali epatici simulano il metabolismo dei mammiferi e attivano metabolicamente i mutageni.

Rappresentazione schematica del test di Ames classico [https://laboratoryinfo.com/ames-test/]
Figura 3 – Rappresentazione schematica del test di Ames classico [https://laboratoryinfo.com/ames-test/]

Quello appena descritto è il test di Ames classico (Fig. 3), che fino a poco tempo fa era reputato come il più sicuro e più utilizzato al mondo. Attualmente la sua applicazione si è ridotta, dal momento che è un esame impegnativo, presuppone una grande quantità della sostanza e richiede parecchio tempo. Al fine di ovviare a tali inconvenienti, è stato introdotto il test di Ames in formato piastra microtiter (MPF) che, malgrado rimanga fedele ai principi del test classico, presenta multipli vantaggi, tra cui una maggiore rapidità, una dose minore di campione occorrente, l’uso di ceppi batterici controllati e con proprietà sicure, l’utilizzo della metodica colorimetrica, che risulta in un’interpretazione più facile, l’impiego della piastra microtiter, che rende il test meno laborioso, la diminuzione della plasticheria necessaria, quindi un costo minore, e infine la disponibilità di un kit pronto all’uso (Fig. 4)

Kit per il test di Ames in piastra microtiter [https://www.biotoxik.it/wp-content/uploads/2019/05/A1-Cenni-di-base.pdf]
Figura 4 – Kit per il test di Ames in piastra microtiter [https://www.biotoxik.it/wp-content/uploads/2019/05/A1-Cenni-di-base.pdf]

Sia nel test classico che in quello su piastra microtiter, i ceppi batterici impiegati sono i seguenti:

  • TA1535 (S. typhimurium), che contiene la mutazione missenso hisG46, che può essere invertita da un’ampia varietà di carcinogeni che inducono sostituzioni di basi azotate ma non da mutageni che causano mutazioni frame-shift;
  • TA1536 (S. typhimurium), che presenta la mutazione frame-shift hisC207, che può essere invertita dalle mostarde azotate eterocicliche;
  • TA1537 (S. typhimurium), che include la mutazione frame-shift hisC3076;
  • TA98, contenente la mutazione frame-shift hisD3052, che può essere invertita da sostanze come il 2-nitrofluorene;
  • TA100, contenente la stessa mutazione del ceppo TA1535;
  • WP2 (E. coli) e WP2 uvrA (E. coli), che includono una mutazione non senso a livello del gene trpE65; il secondo presenta anche la mutazione di umuDC e un deficit di MutY glicosidasi.

La procedura del test di Ames MPF, rappresentata in figura 5, comincia con la preparazione overnight della coltura in terreno liquido. Il secondo giorno si attua la determinazione del valore OD600, ovvero la densità ottica della coltura mediante lettura spettrofotometrica alla lunghezza d’onda di 600 nm, che serve per stimare la concentrazione batterica. Dopodiché si preparano sei concentrazioni del campione da analizzare, con il quale i batteri vengono messi a contatto per 90 minuti, insieme a un controllo positivo (CP) e un controllo negativo (CN).

Nel CP si adoperano dei mutageni standard a una concentrazione nota, nel CN il composto oggetto d’esame viene sostituito dal solvente usato per creare le diverse diluizioni (generalmente è il dimetilsulfossido, DMSO, un sotto-prodotto della lavorazione della carta utilizzato anche per la crioconservazione delle cellule). In questa fase si usufruisce di un terreno che include una quantità idonea di istidina o triptofano, affinché le cellule possano andare incontro all’incirca a due divisioni. Una volta che le colture sono state miscelate con il mutageno, i batteri vengono diluiti in un terreno sprovvisto di istidina o triptofano e contenente un indicatore di pH; successivamente si esegue l’aliquota in 48 pozzetti di una piastra da 384 pozzetti. Nel giro di due giorni le cellule in cui è avvenuta la retromutazione avranno proliferato e, poiché il metabolismo batterico rilascia metaboliti che abbassano il pH del terreno, si vedrà un cambiamento di colore nei pozzetti in cui sono presenti batteri mutati.

A questo punto si effettua la conta delle colonie retromutate per ogni diluizione, per poi compararle con il controllo negativo. Ogni concentrazione viene esaminata in triplicato al fine di consentire un’analisi statistica dei dati. Un aumento notevole e dose dipendente del numero di colonie che hanno subito la reversione della mutazione dopo il contatto con il campione, in relazione al controllo negativo, dimostra la mutagenicità della sostanza testata.

Rappresentazione sintetica del procedimento del test di Ames MPF [https://www.biotoxik.it/wp-content/uploads/2019/05/A1-Cenni-di-base.pdf]
Figura 5 – Rappresentazione sintetica del procedimento del test di Ames MPF [https://www.biotoxik.it/wp-content/uploads/2019/05/A1-Cenni-di-base.pdf]

Limiti del test

Nonostante i suoi molteplici vantaggi, questa metodica non è certo priva di inconvenienti. Innanzitutto, non permette di determinare l’effetto genotossico indiretto, cioè le sostanze che diventano tossiche solo dopo essere state metabolizzate negli organismi superiore. Tuttavia, come abbiamo accennato in precedenza, tale ostacolo si risolve unendo al terreno di coltura l’estratto di fegato. Questo si ottiene trattando un animale da laboratorio con fenobarbital, un farmaco barbiturico che viene trasportato nel fegato e metabolizzato dal sistema microsomiale epatico, che subisce ipertrofia (aumento della concentrazione degli enzimi che degradano gli xenobiotici). A questo punto l’animale viene sacrificato e si prepara l’estratto di enzimi epatici.

Un altro svantaggio riguarda l’impossibilità di analizzare alcune sostanze la cui attivazione richiede l’infiammazione, ad esempio l’amianto.

In aggiunta a ciò, bisogna ricordare che il test di Ames, dal momento che si attua su cellule batteriche, non è adatto per studiare l’abilità dei mutageni di alterare la struttura cromosomica del DNA umano. Di conseguenza, è opportuno realizzarlo in simultaneità con saggi su cellule eucariotiche (test della cometa, test dei micronuclei) e su animali in vivo. In ogni caso, c’è una correlazione accettabile tra la mutagenicità appurata nel test di Ames e la cancerogenicità della sostanza negli organismi superiori.

Controllo di qualità

Nelle analisi di laboratorio, il concetto di “controllo di qualità” si riferisce a una serie di procedure che vengono messe in atto allo scopo di ridurre la variabilità dei risultati e aumentare l’affidabilità dei metodi utilizzati. Affinché si soddisfino questi due aspetti, è necessario che gli operatori, quando svolgono uno specifico test, si attengano alle seguenti fasi:

  • Selezione di un progetto sperimentale appropriato;
  • Rigida adesione ai protocolli e alle procedure operative standard;
  • Garanzia del test e sicurezza dei dati;
  • Attenta interpretazione e revisioni dei dati conseguiti;
  • Presentazione accurata dei risultati.

Nel test di Ames il controllo di qualità si fonda sui processi qui elencati:

  • Controllo della sterilità dei terreni di coltura (solidi o liquidi), che si determina incubando i terreni a 37 °C per 24 ore. Ogni terreno in cui si nota la presenza di crescita batterica deve essere scartato;
  • Valutazione della sterilità dei solventi, dei reagenti e dei mutageni standard mediante l’applicazione di aliquote da 0,1 ml della sostanza in questione sui terreni di coltura, che poi vengono incubati a 37 °C per 24 ore. Se avviene la crescita batterica, quel componente va escluso oppure, se possibile, sterilizzato di nuovo;
  • Impiegare un controllo negativo e un controllo positivo. Il primo è necessario al fine di valutare la frequenza di reversione spontanea dei ceppi usati, che viene comparata con i valori derivati dal trattamento con il mutageno da testare. Il secondo occorre per confermare la capacità di reversione e la specificità di ogni ceppo, e l’efficacia del sistema di attivazione metabolica. Questi due controlli sono analizzati insieme al saggio di mutagenicità;
  • Determinare che le colonie contate siano, effettivamente, istidina/triptofano-indipendenti piuttosto che il risultato di una crescita anomala del background di colonie istidina/triptofano-dipendenti. Questa operazione si esegue seminando le colonie su un terreno agar minimo supplementato con biotina; le cellule istidina/triptofano-indipendenti formeranno nuove colonie sul terreno minimo, mentre quelle istidina/triptofano-dipendenti non cresceranno.    

Fonti

Condividi l'articolo di Microbiologia Italia:

Lascia un commento