DRBC Agar per il conteggio di lieviti e muffe negli alimenti.

Perché si usa?

DRBC (Dichloran-Rose Bengal Chloramphenicol) Agar è un terreno di coltura selettivo impiegato per il conteggio dei lieviti e delle muffe negli alimenti e nei mangimi, con un’attività dell’acqua o acqua libera superiore a 0,95 (a_w>0,95).

Attività dell’acqua o acqua libera (a_w): è la quantità di acqua libera, non legata chimicamente, presente in un alimento.

Contaminazione degli alimenti da lieviti e muffe

I lieviti e le muffe ritrovabili negli alimenti comprendono più di un centinaio di specie, estremamente versatili nei requisiti ambientali per la sopravvivenza e la crescita. I funghi possono invadere e crescere virtualmente su qualsiasi tipo di alimento, in qualsiasi momento, causandone vari gradi di deterioramento. L’alimento contaminato può essere leggermente o gravemente alterato o completamente decomposto. La loro presenza si manifestata con macchie di varie dimensioni e, occasionalmente, un alimento può apparire privo di muffe, ma all’esame micologico risultare contaminato. Diverse muffe e forse anche lieviti presenti negli alimenti possono essere pericolosi per la salute umana o animale a causa della loro capacità di produrre metaboliti tossici noti come micotossine.

Un po’ di storia

Lo sviluppo dei terreni di coltura per l’isolamento e l’enumerazione dei lieviti e delle muffe negli alimenti si è perfezionato sempre più nel tempo.

I primi terreni selettivi erano acidificati per sopprimere la crescita batterica e tra questi, il Malt Extract Agar, il Malt Agar ed il Potato Dextrose Agar acidificati sono usati ancora oggi per specifici campioni. In seguito, l’aggiunta di antibiotici a terreni con un pH più elevato ha permesso la crescita di una gamma più ampia di funghi ed un miglioramento nel recupero delle spore fungine stressate sub-letalmente. Un ulteriore miglioramento si ottenne con l’impiego del rosa bengala per contenere la diffusione delle colonie di muffe sulla piastra e Jarvis nel 1973 propose il Rose-Bengal-Chloramphenicol (RBC) Agar.

King, Hocking e Pitt nel 1979 idearono il DRBC Agar, combinando il dicloran al rosa bengala per meglio limitare lo sviluppo aereo miceliare delle muffe ed il diametro delle loro colonie. Questo terreno è ora raccomandato dalla norma ISO 21527-1 per l’enumerazione di lieviti e muffe nei prodotti destinati al consumo umano ed all’alimentazione animale, aventi un’attività dell’acqua superiore a 0,95 (es. uova, carne, prodotti lattiero-caseari fatta eccezione per il latte in polvere, frutta, verdura, paste fresche). DRBC Agar è inoltre previsto dal FDA-BAM per l’analisi di campioni contenenti muffe “invasive” (ad esempio, Mucor, Rhizopus, ecc.).

Per il conteggio dei lieviti e delle muffe negli alimenti con a_w ≤ 0,95 si utilizza il terreno DG18 Agar, in accordo alla norma ISO 21527-2 ed a FDA-BAM.

Composizione del terreno DRBC Agar

DRBC Agar, formula per litro (ISO 21527-1)

Digerito enzimatico di tessuti animali e vegetali	5 g
D-Glucosio	10 g
Potassio diidrogenofosfato	1 g
Magnesio solfato idrato	0,5 g
Dicloran (2,6-dicloro-4-nitroanilina)	0,002 g
Rosa bengala	0,025 g
Cloramfenicolo	0,1 g*
Agar	12-15 g

*Il cloramfenicolo non è presente in alcuni terreni in polvere del commercio e deve quindi essere aggiunto separatamente (vedi preparazione del terreno)

pH finale (20-25°C): 5,6 ± 0,2

Come funziona il DRBC Agar ?

Il digerito enzimatico di tessuti animali e vegetali fornisce azoto, carbonio e minerali per la crescita microbica. Il glucosio è una fonte di carbonio ed energia. Il potassio diidrogenofosfato tampona il terreno ed il solfato di magnesio favorisce la crescita fungina.

La combinazione di dicloran e rosa bengala, a pH 5,6, oltre ad avere un’attività antibatterica, limita lo sviluppo aereo dei miceli ed il diametro delle colonie delle muffe. Questa caratteristica restrittiva rende il terreno di coltura particolarmente adatto per l’enumerazione, in quanto consente la crescita non oscurata di funghi che normalmente formano piccole colonie.

Il cloramfenicolo è un antibiotico ad ampio spettro che sopprima la crescita di un’ampia gamma di batteri Gram-negativi e Gram-positivi.

Preparazione del terreno DRBC Agar

Trasferire in un matraccio tra 28,6 e 31,6 g di terreno in polvere, in funzione della quantità di agar presente nella formulazione disponibile commercialmente.

Aggiungere 1000 ml di acqua purificata e mescolare con cura. Portare ad ebollizione agitando frequentemente per sciogliere completamente la polvere.

Nel caso si utilizzasse un terreno in polvere privo di cloramfenicolo, addizionare 10 ml di una soluzione al 1% in etanolo di cloramfenicolo, oppure il supplemento selettivo liofilizzato disponibile commercialmente, ricostituito secondo le indicazioni del produttore.

Sterilizzare in autoclave a 121°C per 15 minuti. Raffreddare a 44-50°C, mescolare bene e distribuire in aliquote da 15 mL in piastre di Petri sterili. Evitare l’esposizione del terreno alla luce.

Metodo di semina del DRBC Agar

La procedura qui descritta è una sintesi del metodo descritto dalla norma ISO 21527-1 per i prodotti destinati al consumo umano ed alla alimentazione animale. Considerando la natura aerobica dei lieviti e delle muffe, la semina in superficie è preferibile a quella per inclusione.

Su una piastra di DRBC Agar, utilizzando una pipetta sterile, trasferire 0,1 ml del campione in esame se liquido o 0,1 ml della sospensione iniziale nel caso di altri prodotti.
Per facilitare il conteggio di cariche fungine basse, distribuire 0,3 mL del campione o 0,3 ml della sospensione iniziale su tre piastre o su una piastra di diametro 140 mm.
Ripetere questa operazione con le diluizioni successive, utilizzando una nuova pipetta sterile per ogni diluizione decimale.
Distribuire uniformemente il liquido sulla superficie dell’agar con un dispositivo sterile fino a completo assorbimento dell’inoculo nel terreno.
Incubare in aerobiosi a 25 ± 1°C per 5 giorni, con il coperchio rivolto verso l’alto.

Attenzioni

È possibile aggiungere al diluente per la preparazione del campione (es acqua peptonata 0,1%) agenti tensioattivi, come il Tween 80 (0,05 %), per ridurre l’aggregazione delle spore e dei conidi.
Si raccomanda di incubare le piastre in un sacchetto di plastica aperto per non contaminare l’incubatore in caso di diffusione delle muffe fuori dalle piastre.
Le spore delle muffe si disperdono nell’aria con grande facilità, maneggiare le piastre di Petri con cura per proteggere l’operatore e per evitare lo sviluppo di colonie satellite che darebbero una sovrastima della popolazione nel campione.

Risultati della crescita su DRBC Agar

Leggere le piastre tra il secondo ed il quinto giorno di incubazione e contare le colonie nelle piastre contenenti meno di 150 colonie. Se le muffe a crescita rapida rappresentassero un problema, contare le colonie dopo 2 giorni e di nuovo dopo 5 giorni di incubazione.

Se necessario, effettuare un esame delle colonie con una lente d’ingrandimento binoculare o con un microscopio al fine di distinguere le cellule dei lieviti o delle muffe dai batteri e, se richiesto, contare separatamente le colonie di lieviti e le colonie di muffe.

Per l’identificazione, selezionare le aree di crescita fungina e rimuoverle per un esame microscopico ad elevato ingrandimento o per inoculare gli appropriati terreni di isolamento o di identificazione.

Riportare i risultati come numero di colonie per grammo o millilitro di campione.

Immagini

Conteggio di Candida albicans su DRBC Agar — *Figura 1 – Candida albicans su DRBC Agar*

*Figura 2 – Aspergillus brasiliensis su DRBC Agar*

Controllo qualità del DRBC Agar

I terreni disponibili commercialmente sono sottoposti a rigorosi controlli di qualità per verificarne la conformità alle specifiche. L’utilizzatore può comunque eseguire il proprio controllo di qualità sulle piastre preparate in laboratorio, in funzione dei requisiti regolamentari e delle norme di accreditamento. ISO 11133 suggerisce i seguenti ceppi, avendo come riferimento il Sabouraud Dextrose Agar per calcolare l’indice di produttività (P_R:UFC su DRBC Agar/UFC su SDA):

Ceppo	Tipo di test	Inoculo	Risultati attesi
Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763	Quantitativo	80-120 UFC/piastra	PR ≥ 0,5 *
Candida albicans ATCC 10231	Quantitativo	80-120 UFC/piastra	PR ≥ 0,5 *
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404	Quantitativo	80-120 UFC/piastra	PR ≥ 0,5 *
Mucor racemosus ATCC 42647	Quantitativo	80-120 UFC/piastra	PR ≥ 0,5 *
Escherichia coli ATCC 25922	Qualitativo	10⁴ – 10⁶ UFC/piastra	Nessuna crescita

Incubazione: 25°± 1°C, 5 giorni, aerobiosi
*colonie caratteristiche in funzione della specie

Limitazioni all’utilizzo del terreno DRBC Agar

Evitare l’esposizione del terreno alla luce, poiché i prodotti di decomposizione citotossica possono determinare una sottostima della microflora nei campioni.
Il metodo qui descritto non è adatto per l’enumerazione delle spore fungine e dei funghi resistenti al calore, come Byssochlamys fulva o Byssochlamys nivea.
Secondo la norma ISO 21527-1, quando per determinati campioni (es. carne cruda) la sovra-crescita batterica può costituire un problema, si può impiegare una associazione di cloramfenicolo 50 mg/L e cloratetraciclina HCl 50 mg/L. In questo caso utilizzare un terreno in polvere privo di cloramfenicolo ed addizionare le appropriate soluzioni dei due antibiotici.
Per evitare la sovra-crescita di Mucoraceae sulle piastre, ISO 21527-1 raccomanda l’aggiunta di Tergitol (1 ml/l) al terreno di coltura.
I metodi di conteggio dei lieviti e soprattutto delle muffe sono imprecisi e spesso non è rispettata la linearità nel numero di UFC in diluizioni diverse, perché essi sono costituiti da una miscela di micelio e spore asessuate e sessuate. Il numero di unità formanti colonie dipende dal grado di frammentazione del micelio e dalla proporzione di spore in grado di crescere sul terreno in piastra.