Citocromo c

Scoperta e caratterizzazione del Citocromo C

La scoperta del citocromo c si può considerare frutto di un processo graduale. Nel 1884 il medico irlandese Charles Alexander MacMunn descrisse le mioematine e le istoematine, cioè sostanze colorate presenti nei tessuti animali, sia vertebrati che invertebrati, e ne intuì la funzione respiratoria. Tuttavia, i progressi in questo campo di ricerca non furono immediati e soltanto nel 1925 il biologo russo David Keilin riscoprì il lavoro di MacMunn e ribattezzò le istoematine chiamandole “citocromi” (dal greco: kýtos, cellula; e chrōma, pigmento). Keilin classificò quindi i citocromi in 4 categorie (a, b, c, d) in base al loro spettro di assorbimento.

I citocromi c si distinguono dagli altri citocromi perché, quando trasportano un elettrone, assorbono luce di lunghezza d’onda pari a 550 nm. A causa dell’assorbimento di questa particolare luce verde, l’occhio umano acquisisce la percezione di un rosso intenso.

Struttura molecolare

Il colore è conferito al citocromo c dalla presenza del ferro del gruppo eme legato covalentemente con una catena proteica di circa 100 aminoacidi, ripiegata in 5 α-eliche (Fig. 1), per un peso molecolare complessivo di 12,4 kDa. Il legame del gruppo eme si trova in una regione evolutivamente conservata vicina all’estremità N-terminale della catena, e si realizza attraverso gli atomi di zolfo delle catene laterali di due cisteine. La particolare disposizione degli atomi attorno al gruppo eme conferisce alla molecola una notevole varietà di funzioni. Inoltre, a causa di una regione ricca di cariche elettriche negative, la proteina è capace di orientarsi nello spazio, mentre trasporta l’elettrone.

Funzioni biologiche del citocromo c

Il citocromo c trasporta elettroni nella respirazione cellulare

Il citocromo c è un componente fondamentale della catena di trasporto degli elettroni, che ha luogo nei mitocondri (Fig. 2). Visto che l’atomo di ferro risulta stabile sia con carica 2+ che con carica 3+, esso scambia facilmente un elettrone, ricevendolo da un enzima donatore (il Complesso III della catena respiratoria) e donandolo a un accettore (il Complesso IV). Poiché il citocromo c è disciolto nel liquido compreso tra le due membrane mitocondriali, esso si trova a fare in continuazione la spola tra i due complessi proteici di membrana.

Citocromo c e apoptosi

Il citocromo c svolge anche un ruolo cruciale nell’attivazione della via apoptotica intrinseca (Fig.3). Quando dei segnali di stress cellulare raggiungono il mitocondrio, si formano dei pori che permettono la fuoriuscita del citocromo c nel citoplasma. Inizialmente, il suo legame con il fosfolipide cardiolipina, presente nella membrana mitocondriale interna, impedisce il suo rilascio all’esterno del mitocondrio. Tuttavia, il complesso formato da citocromo c e cardiolipina ha un’attività perossidasica che ossida e deteriora la cardiolipina stessa, provocando la liberazione del citocromo c che fuoriesce dai mitocondri attraversando i pori.

Una volta nel citoplasma, il citocromo c forma dei complessi proteici, assieme alle proteine Apaf1 e caspasi-9, complessi che sono chiamati apoptosomi. L’assemblaggio in un’unica struttura provoca come conseguenza l’attivazione della caspasi-9 (iniziatrice) che agisce a cascata su altre caspasi (effettrici) le quali a loro volta hanno il compito di attuare il suicidio controllato della cellula. La caspasi-9 viene attivata anche grazie a un secondo meccanismo: infatti, il citocromo c è in grado di provocare la fuoriuscita in massa degli ioni Ca²⁺ depositati nel reticolo endoplasmatico, fino a livelli tossici per la cellula, che mettono in azione sempre la caspasi-9.

L’ultima funzione del citocromo c si realizza quando esso viene liberato all’esterno delle cellule. In questi casi esso agisce come molecola associata al danno tissutale, quindi stimola le difese immunitarie ed innesca una reazione infiammatoria. Un meccanismo come questo è stato scoperto nel cervello, dove i segnali di danno stimolano la fagocitosi da parte delle cellule della microglia. Queste producono quindi delle citochine infiammatorie che portano a morte i neuroni come nelle malattie di Alzheimer e di Parkinson.

Via biosintetica del citocromo c

L’assemblaggio del citocromo c, con modalità che possono essere diverse a seconda dell’organismo considerato, avviene nello spazio compreso tra le due membrane mitocondriali. Qui, nel caso degli animali, un enzima (olocitocromo-c sintasi) lega una catena proteica, codificata dal DNA nucleare e proveniente dal citosol, chiamata apocitocromo c, con un gruppo eme sintetizzato nella matrice mitocondriale (Fig. 4).

Immagini

*Figura 1 – Modello tridimensionale del citocromo c umano determinato tramite cristallografia a raggi X [Fonte: Fagerlund, R.D., Wilbanks, S.M.]*

Il complesso III (citocromo bc1), il complesso IV (citocromo c ossidasi) e il citocromo c nella catena di trasporto degli elettroni. Gli elettroni provenienti dai complessi I e II vengono trasferiti all'ubichinone (Q) nella membrana mitocondriale interna. Successivamente, gli elettroni vengono trasferiti al complesso III, poi al citocromo c e dopo ancora al complesso IV, che alla fine inserisce gli elettroni in una molecola d'acqua — Figura 2 – Il complesso III (citocromo bc₁), il complesso IV (citocromo c ossidasi) e il citocromo c nella catena di trasporto degli elettroni. Gli elettroni provenienti dai complessi I e II vengono trasferiti all’ubichinone (Q) nella membrana mitocondriale interna. Successivamente, gli elettroni vengono trasferiti al complesso III, poi al citocromo c e dopo ancora al complesso IV, che alla fine inserisce gli elettroni in una molecola d’acqua [Fonte: Boes D.M, Godoy-Hernandez A, McMillan DGG, 2021]

La via intrinseca dell'apoptosi. Un disegno schematico di come il citocromo c rilasciato dai mitocondri attiva Apaf1. Il legame del citocromo c induce Apaf1 a idrolizzare il dATP a dADP. La sostituzione del dADP con dATP o ATP induce poi il complesso di Apaf1-citocromo c ad aggregarsi per formare un grande apoptosoma, che a sua volta recluta la procaspasi-9 attraverso il dominio di reclutamento delle caspasi (CARD). Le molecole di procaspasi-9 vengono attivate all'interno dell'apoptosoma e sono ora in grado di attivare le procaspasi esecutrici in una cascata di caspasi — Figura 3 – La via intrinseca dell’apoptosi. Un disegno schematico di come il citocromo c rilasciato dai mitocondri attiva Apaf1. Il legame del citocromo c induce Apaf1 a idrolizzare il dATP a dADP. La sostituzione del dADP con dATP o ATP induce poi il complesso di Apaf1-citocromo c ad aggregarsi per formare un grande apoptosoma, che a sua volta recluta la procaspasi-9 attraverso il dominio di reclutamento delle caspasi (CARD). Le molecole di procaspasi-9 vengono attivate all’interno dell’apoptosoma e sono ora in grado di attivare le procaspasi esecutrici in una cascata di caspasi [Fonte: IFAS Publications]

Figura 4 – Rappresentazione schematica dell’assemblaggio del citoctomo c, così come avviene negli animali e nei funghi. Una singola proteina (HCCS, holocytochrome-c synthase) associata alla membrana mitocondriale interna è necessaria per la maturazione del citocromo c [Fonte: Travaglini-Allocatelli C, 2013]

*Figura 5 – Filogenesi basata sulle differenze nella sequenza proteica del citocromo c in diverse specie che vanno dalla muffa Neurospora all’uomo [Fonte: Encyclopædia Britannica, Inc.]*

Applicazioni biotecnologiche e mediche del citocromo c

Negli ultimi anni sono state sviluppate diverse applicazioni del citocromo c sia nel settore della ricerca di base sia in ambito clinico.

Per le sua proprietà elettriche il citocromo c è stato sfruttato per costruire dei biosensori in grado di riconoscere sostanze come il perossido d’idrogeno (acqua ossigenata), l’anione superossido, l’ossido nitrico e la vitamina C.
Nella spettrometria di massa, quantità note di citocromo c servono a calibrare lo strumento, al fine di garantire l’accuratezza nelle misure.
Il livello di citocromo c nel plasma sanguigno viene analizzato tramite diverse tecniche (ELISA, Western Blotting, HPLC), indica danno cellulare e apoptosi e serve anche a monitorare l’efficacia di alcuni trattamenti come la chemioterapia.
Inoltre, Il citocromo c fa parte del kit del saggio della citocromo c ossidasi (complesso IV). Si può rilevare l’attività del complesso IV proprio quando c’è una diminuzione nell’assorbimento della luce a 550 nm da parte del citocromo c. Questo dato serve a valutare l’efficienza della respirazione cellulare.
Infine, il citocromo c può essere considerato un orologio molecolare. Il suo gene codificante è infatti presente in tutti i regni dei viventi ed è altamente conservato. Ammettendo che la sua evoluzione nel tempo sia stata costante, si possono utilizzare le differenze nella sua sequenza aminoacidica allo scopo di stabilire i rapporti di parentela tra le varie specie viventi (Fig.5). Per esempio il citocromo c umano ha la stessa sequenza dei quello dello scimpanzé, differisce da quello del macaco per un solo aminoacido e da quello del coniglio per 9 aminoacidi.

Polimorfismi genetici

Sono noti casi di organismi con 2 o 3 diverse forme di citocromo c (topo, pesce palla giapponese), ma nella specie umana viene espressa un’unica forma della proteina. Sono state comunque riconosciute sul DNA umano le sequenze di diversi pseudogeni per il citocromo c, che erano espressi nei nostri antenati, ma che nel corso dell’evoluzione della nostra specie sono andati spegnendosi.

Fonti

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Crediti immagini

Immagine in evidenza: https://media.sketchfab.com/models/862c3ad1d03b450fa23c2186d924c4e1/thumbnails/b367ef5e78d04ce78ca8a1e7ea751d1c/ba5313fd29524100a4cc223e5204ff54.jpeg
Figura 1: https://cdn1.sinobiological.com/styles/default/images/protein-structure/CYCS-protein-structure.jpg
Figura 2: https://pub.mdpi-res.com/membranes/membranes-11-00346/article_deploy/html/images/membranes-11-00346-g006.png
Figura 3: https://cdn.numerade.com/ask_images/e73cb1b9e15b4d2d9bc73171c3a7158c.jpg
Figura 4: https://onlinelibrary.wiley.com/cms/asset/ab85bd3f-32b4-4898-8887-cd1e2a40e9df/sci5505714-fig-0004-m.png
Figura 5: https://cdn.britannica.com/03/403-050-F1B9349F/Phylogeny-differences-cytochrome-c-protein-sequence-organisms.jpg