Diagnosi batteriologica

Diagnosi batteriologica diretta ed indiretta

La diagnosi batteriologica ha lo scopo di identificare l’agente patogeno responsabile di una malattia infettiva e di valutare la suscettibilità antimicrobica del ceppo in esame al fine di suggerire un appropriato trattamento chemio-antibiotico. L’indagine microbiologica può essere anche utilizzata per valutare l’efficacia della terapia, nonché la presenza di portatori sani. Questi potrebbero costituire una fonte di contagio in comunità e, ancor più grave, in ambito ospedaliero.

Ad esempio, il chirurgo che risulti a un’indagine microbiologica portatore sano nel vestibolo nasale anteriore di un ceppo di Staphylococcus aureus meticillino-resistente dovrebbe essere bonificato. La diagnosi batteriologica si distingue in:

  • diagnosi diretta quando essa è volta a isolare l’agente patogeno;
  • diagnosi indiretta quando essa è tesa a rilevare la risposta immunitaria dell’ospite all’agente infettivo.

Diagnosi batteriologica diretta

Raccolta del materiale biologico

L’attendibilità dell’esame batteriologico dipende da vari fattori, tra i quali molto importante è l’adeguata raccolta del campione. Il prelievo del campione deve essere effettuato prima dell’inizio di una terapia chemio-antibiotica o dopo sospensione della stessa per almeno 48 ore. Il campione deve essere prelevato dal distretto corporeo dal quale sia più facile isolare l’agente patogeno in quella particolare fase della malattia infettiva.

La febbre tifoide, ad esempio, ha classicamente un decorso bimodale, essendo caratterizzata da una fase precoce (di una/due settimane) di febbre e costipazione, durante la quale l’emocoltura è positiva nel 90-100% dei casi e la coprocoltura è frequentemente negativa, e da una seconda fase, spesso diarroica, durante la quale Salmonella typhi può essere isolata con sempre maggiore frequenza dalle feci e con minore frequenza dal sangue (30% nella terza settimana). Il sospetto clinico di febbre tifoide, unito alla conoscenza della storia naturale di questa malattia infettiva, suggerisce, pertanto, la ricerca del microrganismo nel sangue durante la prima e seconda settimana di malattia e nelle feci nella terza e quarta settimana.

Il prelievo di sangue, l’agoaspirato (aspirato di un essudato o pus) o il prelievo effettuato a mezzo di un tampone devono essere raccolti in contenitori sterili. Il tampone deve essere di dacron o di poliestere. Sia i residui di acidi grassi eventualmente presenti nel tampone di cotone, sia i prodotti tossici che possono essere rilasciati dal tampone di alginato di calcio, inibiscono, infatti, la crescita di alcuni microrganismi. Il prelievo di sangue e l’agoaspirato devono essere effettuati dopo accurata disinfezione della superficie corporea. Il campione può essere prelevato da un distretto corporeo normalmente sterile (ad es., sangue, liquor, liquido sinoviale, bile) o da distretti colonizzati dalla flora microbica locale (ad es., tratto genitourinario, cute).

In quest’ultimo caso si deve effettuare il prelievo evitando la contaminazione del campione con i tessuti circostanti. Seguendo questo razionale, ad esempio, la ricerca di Streptococcus pyogenes va effettuata con un tampone nelle fosse peritonsillari evitando il contatto con l’orofaringe, così, nel caso di raccolta di un campione endometriale, si deve cercare di limitare la contaminazione con la flora vaginale, mentre il pus va raccolto dalla lesione sottostante e non dalla sua fistola. In ultimo, il campione deve essere correttamente etichettato e accompagnato da una richiesta nella quale si specificano sufficienti informazioni cliniche, il sospetto diagnostico e il tipo di esame che si vuole prescrivere.

Metodi di diagnosi batteriologica per identificare l’agente batterico responsabile di una malattia infettiva
Figura 1 – Metodi di diagnosi batteriologica per identificare l’agente batterico responsabile di una malattia infettiva

Invio del campione

La processazione del campione deve essere più tempestiva possibile. Il campione che non venga prontamente processato deve essere messo in un mezzo di trasporto, al fine di evitare l’essiccamento dello stesso e, quindi, la morte dei microrganismi. A tale scopo è indicato l’uso del terreno semisolido di Stuart o di Amies. Qualora si debbano mantenere in vita microrganismi anaerobi, il campione non deve essere esposto né all’ossigeno né all’essiccamento e all’uopo sono disponibili in commercio contenitori adatti.

Feci e urine, nel caso non possano essere inoculati negli opportuni terreni in tempi brevi, devono essere conservati a 4 °C per un massimo di 6-8 ore.

Esame batterioscopico diretto per la diagnosi batteriologica

L’esame batterioscopico diretto del materiale biologico è utile per stimare l’idoneità del campione (come nel caso dell’espettorato), per valutare il numero e la percentuale di polimorfonucleati neutrofili, indicativi di un processo infiammatorio, per documentare la presenza di lattobacilli acidofili in un campione vaginale, indicativi di una normale flora microbica locale, nonché per informare precocemente il clinico circa la presenza di funghi, parassiti, inclusioni virali, batteri, dei quali può essere specificata la caratteristica tintoriale dopo colorazione di Gram o di Ziehl Nielsen, la morfologia (cocchi o bastoncelli), la disposizione (in ammassi irregolari, catenelle, diplococchi lanceolati, diplococchi a chicco di caffè), l’eventuale presenza di capsula, spore, granuli metacromatici previa colorazione specifica.

Queste caratteristiche possono risultare utili per una diagnosi presuntiva e, comunque, importanti per la prosecuzione del processo diagnostico, nella scelta, cioè, dei terreni di coltura più idonei su cui seminare il campione. Un referto positivo ottenuto, ad esempio, dopo colorazione di Ziehl Nielsen indica la presenza di bacilli alcol-acido-resistenti e non, necessariamente, di Mycobacterium tuberculosis. In caso di negatività dell’esame batterioscopico diretto è necessario ricordare che il limite di sensibilità di questa metodica è di circa 104 batteri/mL di materiale.

Esame colturale

Il campione arrivato in laboratorio con richiesta generica per la ricerca di “germi comuni” o specifica per un particolare microrganismo viene seminato sui terreni di coltura appropriati al tipo di richiesta e al tipo di campione. Per ricerca di “germi comuni” si intende la ricerca di tutti quei microrganismi che crescono nei comuni terreni di coltura. In genere, la ricerca per “germi comuni” viene effettuata seminando il campione su terreni solidi.

L’inoculo in terreni liquidi è spesso limitato a quei campioni quali, ad esempio, i liquidi corporei e gli aspirati di tessuti profondi, nei quali la carica microbica si presume non sia molto elevata e dai quali l’isolamento, anche di pochi microrganismi, può essere significativo. I terreni possono essere selettivi o non selettivi. I terreni non selettivi sono privi di inibitori e consentono la crescita della maggior parte delle specie microbiche.

L’agar sangue, contenente il 5% di sangue (spesso di montone o di cavallo), è il terreno non selettivo più comunemente usato. In questo terreno si mettono in evidenza la β-emolisi (emolisi completa delle emazie presenti nel terreno, che dà luogo a un alone trasparente intorno alla colonia), l’α-emolisi (emolisi parziale, che dà luogo a un alone verde intorno alla colonia per degradazione della bilirubina a biliverdina) e la γ-emolisi (mancanza di emolisi).

L’agar cioccolato è un agar nutriente addizionato di emoglobina, per fornire emina o fattore X, e di IsoVitaleX, che fornisce NAD o fattore V, nonché di vitamine e altri nutrienti. Questo terreno viene utilizzato per l’isolamento di specie esigenti da un punto di vista nutrizionale, quali quelle appartenenti al genere Haemophilus. Il terreno è selettivo quando consente la crescita soltanto di alcune specie microbiche mentre inibisce la crescita di altre specie grazie a una o più sostanze chimiche o a uno o più antibiotici contenuti nel terreno. Di seguito sono riportati, come esempio, alcuni tra i terreni selettivi di maggiore impiego in microbiologia clinica: il terreno di Thayer-Martin, l’agar MacConkey, l’agar sale mannite, l’agar SS.

Il terreno di Thayer-Martin, un terreno selettivo per le neisserie patogene, è costituito di agar cioccolato, addizionato di vancomicina, colistina, nistatina e trimetoprim lattato. Questo terreno è utile per l’isolamento di Neisseria gonorrhoeae da un campione uretrale, che è un campione polimicrobico.

L’agar MacConkey è un terreno non soltanto selettivo ma anche discriminativo. Esso è selettivo per i microrganismi gram-negativi in quanto contiene sali biliari (1,5%) e cristalvioletto, che inibiscono la crescita dei microrganismi gram-positivi, ed è discriminativo in quanto è capace di distinguere i batteri gram-negativi in lattosio-fermentanti e non fermentanti. Questo terreno è, pertanto, particolarmente utile per discriminare le specie appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae. L’acidificazione del terreno, infatti, che si verifica in presenza di colonie fermentanti il lattosio, fa virare al rosso l’indicatore di pH presente nel terreno, il rosso neutro. La mancata acidificazione del terreno indica, pertanto, la presenza di colonie non fermentanti il lattosio (appartenenti al genere Salmonella, Shigella e Proteus).

Anche l’agar sale mannite è un terreno selettivo e discriminativo. Esso, infatti, contenendo un’elevata concentrazione di cloruro di sodio (7,5%), è selettivo per i microrganismi alofili ed è capace di discriminare le specie di stafilococchi in base alla capacità di utilizzare la mannite. L’acidificazione del terreno che si verifica, infatti, in presenza di colonie fermentanti la mannite (Staphylococcus aureus) fa virare al giallo l’indicatore di pH presente nel terreno, il rosso fenolo.

Per facilitare l’isolamento di quei microrganismi la cui crescita è favorita da una minore tensione parziale di ossigeno e, in alcuni casi, anche da un’atmosfera arricchita in CO2, le piastre, ad esempio, di agar sangue e/o agar cioccolato vengono normalmente incubate in una giara in grado di realizzare tali condizioni. Le condizioni di microaerofilia possono essere ottenute anche utilizzando bustine sigillate in un involucro protettivo, contenenti un generatore di CO2 che viene rilasciato al momento dell’apertura dell’involucro all’interno di una busta trasparente contenente le piastre. La busta trasparente viene immediatamente chiusa per consentire il mantenimento dell’atmosfera generata. Le condizioni di microaerofilia possono essere utilizzate anche per consentire la rilevazione dell’emolisina ossigeno-labile di Streptococcus pyogenes in agar sangue. Tutti i terreni sopra menzionati vengono incubati a 37 °C per 24-48 ore. L’identificazione suggerita dai terreni discriminativi va successivamente confermata.

Identificazione

Una volta che dal campione biologico si sia verificata, sui terreni solidi opportuni, la crescita di colonie batteriche isolate si procede all’identificazione. La determinazione di specie si basa sul profilo di assimilazione degli zuccheri e sulla produzione di specifici enzimi o prodotti metabolici da parte del germe in esame.

La fermentazione degli zuccheri viene evidenziata a mezzo di un indicatore di pH presente nel terreno, il quale cambia colore quando il mezzo colturale diventa acido come conseguenza della metabolizzazione dello zucchero. L’utilizzazione metabolica di altri substrati può essere accompagnata da un aumento di pH e un indicatore di pH cambia colore quando il terreno diventa alcalino.

La produzione di idrogeno gassoso e/o anidride carbonica durante la fermentazione degli zuccheri è valutata mediante la rilevazione del gas prodotto. La produzione di idrogeno solforato (H2S) da parte di un microrganismo, ad esempio, è rilevata in un terreno contenente ferro ferrico, quale l’agar TSI (triple sugar iron): se viene prodotto idrogeno solforato, il ferro ferrico (Fe3+) reagisce con esso formando solfuro ferrico, il quale precipita conferendo una colorazione nera al terreno.

Nonostante siano stati sviluppati centinaia di differenti test biochimici, soltanto una ventina sono abitualmente impiegati in diagnostica e di questi pochi (tre-cinque) sono quelli chiave per un’identificazione certa. Attualmente, nei laboratori di microbiologia clinica, si utilizzano routinariamente kit biochimici miniaturizzati allestiti per sistemi automatizzati dotati di un software e di un sistema esperto, il quale contiene il profilo biochimico tipico di molte specie microbiche. Il software trova la migliore corrispondenza confrontando le caratteristiche metaboliche del microrganismo in esame con i profili metabolici presenti nel sistema esperto e valuterà, quindi, la probabilità con cui il profilo biochimico del microrganismo in esame corrisponde a una particolare specie. Oggi sono disponibili strumentazioni automatizzate in grado di rilevare, con metodi radiometrici o fluorimetrici, la crescita dei micobatteri in coltura liquida, consentendo una refertazione in tempi molto più rapidi.

Antibiogramma

L’antibiogramma è uno step fondamentale della diagnosi batteriologica ed ha lo scopo di saggiare la suscettibilità in vitro di un microrganismo, isolato in coltura pura, verso un pannello di chemio-antibiotici. L’antibiogramma può essere effettuato con metodi manuali o con strumentazioni semiautomatizzate ed è di grande ausilio per assicurare una terapia mirata contro un’infezione batterica.

Diagnosi batteriologica rapida

Metodi immunologici

I metodi immunologici sono tecniche immunologiche applicate alla ricerca diretta di antigeni microbici sul materiale biologico consentono di effettuare una diagnosi batteriologica rapida. Le metodiche più utilizzate sono l’agglutinazione su particelle di lattice, il saggio immunoenzimatico (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay; ELISA) e il saggio di immunocromatografia su membrana.

Anticorpi specifici verso un particolare antigene microbico sono adsorbiti in fase solida (su particelle di lattice nel test di agglutinazione, sulla superficie interna di un pozzetto di una piastra nel saggio immunoenzimatico, su membrana di nitrocellulosa nel saggio di immunocromatografia su membrana). Se l’antigene è presente nel campione, questo si lega all’anticorpo. Se quest’ultimo è adsorbito su particelle di lattice si evidenzia un epifenomeno ben apprezzabile, si ha, cioè, un agglutinato (reazione di agglutinazione positiva). Se invece l’anticorpo è adsorbito sulla superficie interna di un pozzetto di una piastra o su membrana di nitrocellulosa, l’epifenomeno non è altrettanto evidente. Pertanto, in questi casi, è necessario utilizzare un secondo anticorpo verso l’antigene; tale anticorpo viene preventivamente coniugato a un enzima come la perossidasi.

Quando si forma il complesso antigene-anticorpo, anche il secondo anticorpo, coniugato alla perossidasi, si legherà all’antigene. Dopo un lavaggio per eliminare gli anticorpi in eccesso, si aggiunge perossido di idrogeno e il substrato cromogeno. La perossidasi riduce il perossido di idrogeno e ossida il substrato cromogeno producendo colore (reazione del saggio immunoenzimatico positiva o reazione di immunocromatografia positiva, rispettivamente). Nel caso in cui l’antigene non sia presente nel campione, esso non potrà legarsi né all’anticorpo adsorbito né al secondo anticorpo coniugato alla perossidasi. Quest’ultimo, quindi, verrà portato via dal lavaggio e, venendo così a mancare anche la perossidasi, l’aggiunta di perossido di idrogeno e del substrato non produrrà colore.

Tecniche immunologiche rapide vengono comunemente eseguite sul campione di liquor o sul centrifugato da esso ottenuto per la ricerca degli antigeni batterici di streptococchi di gruppo B, Streptococcus pneumoniae, alcuni sierotipi di Neisseria meningitidis, Escherichia coli (antigene capsulare K1 cross-reagisce con quello di Neisseria meningitidis tipo B) e Haemophilus influenzae tipo B. Sul campione di espettorato è possibile eseguire una reazione diretta di rigonfiamento capsulare, la Quellung reaction di Neufeld, con siero polivalente per la ricerca di pneumococchi. In seguito al legame con anticorpi anticapsulari specifici, si verifica un cambiamento conformazionale degli strati polisaccaridici capsulari di Streptococcus pneumoniae con contestuale cambiamento dell’indice di rifrangenza e rigonfiamento capsulare visibile all’esame batterioscopico diretto.

Diagnosi molecolare

I progressi verificatisi in biologia molecolare negli ultimi anni hanno aperto nuove frontiere all’identificazione dei microrganismi. Alcune metodiche di biologia molecolare sono state applicate, infatti, con successo in microbiologia clinica. Tra queste si sono sviluppate principalmente metodiche che si basano sull’analisi di componenti proteiche (spettrometria di massa) o delle sequenze geniche dei microrganismi.

L’analisi delle sequenze geniche è rilevante soprattutto per identificare i microrganismi che non possono essere coltivati in vitro, o il cui isolamento con le metodiche classiche è difficile, inefficiente, non riproducibile o troppo prolungato (micobatteri) e anche per la ricerca dei geni di resistenza antimicrobica. Alcune metodiche di identificazione si basano sull’impiego di sonde di acido nucleico, cioè sequenze di acido nucleico a singolo filamento che possono ibridare specificamente con una sequenza complementare presente nel microrganismo in esame. La sonda marcata con enzimi, molecole chemiluminescenti, o radioisotopi può essere rapidamente individuata da sistemi automatizzati.

Una sonda può essere costruita per ricercare il DNA o l’RNA. La sonda di DNA può essere utilizzata per fare diagnosi rapida di microrganismi di difficile isolamento direttamente sul campione clinico o per confermare una diagnosi a partire dal microrganismo isolato in coltura. Nel primo caso, il limite di sensibilità di questa metodica è di circa 104 -106 copie della sequenza di acido nucleico specifico. Quando la sonda viene, invece, utilizzata sul microrganismo isolato in coltura, il numero di copie della sequenza di acido nucleico specifico è sufficiente per avere un rilevamento efficace. Quando è prevista la fase di amplificazione del DNA, la sonda può arrivare a diagnosticare persino la presenza di dieci copie (in alcuni casi anche meno) della sequenza nucleotidica ricercata.

In microbiologia clinica le sonde vengono ampiamente utilizzate, ad esempio, per l’identificazione dei micobatteri la cui crescita su terreno liquido è stata rilevata da sistemi radiometrici o fluorimetrici. In diagnostica molecolare la metodica più utilizzata è la reazione polimerasica a catena (Polymerase Chain Reaction, PCR). La PCR si basa sulla capacità della DNA polimerasi di copiare un filamento di DNA previo appaiamento dei primer, che sono sequenze oligonucleotidiche fiancheggianti la sequenza bersaglio. Quando i due primer si legano ai filamenti complementari fiancheggianti un DNA bersaglio, la sequenza compresa tra i due siti di legame dei primer viene amplificata esponenzialmente dopo ciascun ciclo del processo. Ciascun ciclo consiste di una fase di denaturazione a caldo, in cui il DNA bersaglio a doppio filamento si separa nei due filamenti di DNA, una fase di annealing, in cui il DNA dei primer si appaia al filamento complementare, e una fase di estensione, in cui la DNA polimerasi copia il DNA bersaglio compreso tra i due primer. Alla fine di ciascun ciclo della reazione polimerasica a catena i filamenti di DNA sono duplicati.

L’intera procedura si svolge all’interno di strumenti programmabili detti termociclatori. Generalmente, 25-40 cicli sono sufficienti a ottenere una quantità di DNA bersaglio evidenziabile attraverso migrazione elettroforetica. I limiti delle metodiche molecolari sono:

  • la facile contaminazione di campioni negativi con il DNA stampo o con il controllo positivo o con un campione eventualmente positivo di un altro paziente analizzato contemporaneamente;
  • l’amplificazione di DNA anche di batteri ormai morti in seguito a trattamento chemio-antibiotico;
  • una possibile cross-reattività con microrganismi diversi;
  • la produzione di risultati falsamente negativi, ad esempio, per la presenza di inibitori degli enzimi usati nel processo di amplificazione;
  • la necessità di utilizzare una coppia di primer specifica per una particolare specie microbica.

Per aumentare lo spettro delle specie microbiche identificabili si può utilizzare la multiplex PCR, che prevede l’uso di coppie di primer multipli entro la stessa provetta di reazione, ciascuna coppia capace di amplificare i frammenti di acido nucleico di un particolare microrganismo. Dalla descrizione iniziale della PCR, oltre alla multiplex PCR, sono state messe a punto altre eleganti metodiche di amplificazione dell’acido nucleico bersaglio, quali la Nested PCR, la 3SR (Self-Sustaining Sequence Replication) o NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) e la SDA (Strand Displacement Amplification).

Alcune metodiche, invece di amplificare la sequenza bersaglio, amplificano la sonda utilizzata per individuare la sequenza genica di interesse, quali la Qβ Replicase e la Ligase Chain Reaction (LCR). La SDA è entrata in uso per la diagnosi di micobatteri del complesso tubercolare (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium microti), micobatteri del complesso avium-intracellulare (Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare), Mycobacterium kansasii, Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, microrganismi appartenenti alla famiglia delle Chlamydiaceae e Neisseria gonorrhoeae.

Un’altra metodica molto sensibile di recente introduzione prevede l’utilizzo di cartucce sigillate monouso contenenti tutti i reagenti necessari all’esecuzione della Real-Time PCR al fine di minimizzare il rischio di contaminazione. Tale metodica, entrata in uso, ad esempio, per l’identificazione di M. tuberculosis, consente una valutazione semi-quantitativa del materiale genetico presente nel campione in esame. Tale quantificazione fornisce un indice indiretto della carica microbica in meno di due ore.

Diagnosi batteriologica indiretta

Determinazioni sierologiche

La diagnosi batteriologica indiretta di un’infezione batterica con tecniche immunologiche è tesa a rilevare una risposta immunitaria umorale specifica dell’ospite all’agente infettivo. Le IgM normalmente sono transitorie e indicative di un’infezione primaria recente, mentre le IgG compaiono più tardivamente, raggiungono un picco 4-6 settimane dopo l’infezione e, spesso, persistono per tempi prolungati. In alcuni casi anche le IgM possono persistere a lungo. È buona norma ricercare le IgG su campioni successivi, il primo prelevato entro cinque-sette giorni dall’inizio dell’infezione e il secondo tre-quattro settimane dopo.

Al fine di diagnosticare un’infezione attiva tramite la diagnosi batteriologica indiretta è necessario rilevare un incremento del titolo anticorpale delle IgG di almeno quattro volte nei due campioni successivi. I saggi immunologici tradizionali sono la reazione di fissazione del complemento e la reazione di agglutinazione. La reazione di fissazione del complemento si applica, ad esempio, alla reazione di Wassermann, per la diagnosi di sifilide. Tale reazione si basa sulla capacità del complemento di legarsi a complessi immuni. A tale scopo si usa un “antigene” lipidico non treponemico, la cardiolipina.

La cardiolipina purificata è ottenuta dal cuore di bovino e richiede l’aggiunta di lecitina e colesterolo per reagire con la reagina sifilitica. La reagina composta da IgM e IgA si ritrova nel siero dei pazienti non trattati due-tre settimane dopo l’inizio dell’infezione. Il siero del paziente deve essere scomplementato per riscaldamento a 56 °C per 20 minuti, e il complemento rappresentato da siero fresco, spesso di coniglio, deve essere aggiunto alla reazione in quantità scrupolosamente titolata. Le reagine contenute nel siero di pazienti infettati da Treponema pallidum fissano, pertanto, il complemento in presenza della cardiolipina. Si deve accertare che il siero non sia anticomplementare.

Per evidenziare l’epifenomeno è necessario aggiungere un sistema rivelatore. Esso è costituito da emazie (spesso di montone) e anticorpi specifici anti-emazie di montone. Il sistema di rivelazione lega il complemento libero (non fissato dalla precedente reazione). Si considera, pertanto, la reazione positiva quando non si ha emolisi e negativa quando si evidenzia l’emolisi. Data la presenza di reagine in numerose affezioni dell’uomo, la reazione di Wassermann può risultare positiva anche in assenza di infezione treponemica, ad esempio in caso di malattie infettive quali malaria, lebbra, morbillo, mononucleosi infettiva, in malattie del collagene, quali lupus eritematoso sistemico, poliarterite nodosa, disturbi reumatici e, persino, in condizioni fisiologiche, quale la gravidanza.

La reazione di Wassermann può, d’altro canto, risultare negativa nella sifilide primaria per cui, in caso di sospetta infezione, l’esame dovrebbe essere ripetuto dopo una settimana, un mese e tre mesi. La reazione di agglutinazione si applica, ad esempio, alla reazione di Wright per la diagnosi di brucellosi e alla reazione di Widal per la diagnosi di salmonellosi. L’antigene corpuscolato comunemente consiste di sospensioni di microrganismi, di cellule (ad es. emazie) o di particelle uniformi come il lattice sulle quali siano stati adsorbiti gli antigeni. Per valutare il titolo degli anticorpi agglutinanti si utilizza una serie di provette in ciascuna delle quali si mette una quantità fissa di antigene e diluizioni scalari di siero in ragione di due. In presenza di siero contenente anticorpi specifici, si formano aggregati di complessi immuni che risultano visibili. In molti casi si osserva il fenomeno paradosso della prezona che consiste nella mancanza di agglutinazione in provette contenenti siero poco o non diluito.

Spesso tale fenomeno è dovuto alla presenza di anticorpi bloccanti monovalenti che, legandosi alle cellule, mascherano i determinanti antigenici agli anticorpi agglutinanti. La reazione di agglutinazione risulterà, tuttavia, positiva a maggiori diluizioni di siero. La presenza di anticorpi bloccanti può essere messa in evidenza con anticorpi antimmunoglobuline, i quali, stabilendo dei ponti tra gli anticorpi bloccanti, provocano l’agglutinazione delle cellule (test di Coombs). I saggi immunologici introdotti più recentemente per la diagnosi delle malattie infettive sono il saggio immunoenzimatico (enzyme immunoassay, EIA), il saggio radioimmunologico (radioimmunoassay, RIA) e il saggio di immunofluorescenza (immunofluorescence assay, IFA).

Essi utilizzano per l’individuazione di anticorpi un enzima che reagirà con un substrato nel saggio immunoenzimatico, una sonda radio-attiva nel saggio radioimmunologico o un fluorocromo nel saggio di immunofluorescenza. Nel saggio immunoenzimatico, ad esempio, l’antigene può essere adsorbito a un pozzetto di una piastra. Se il siero aggiunto contiene l’anticorpo specifico si forma un complesso antigene-anticorpo. Per rivelare l’epifenomeno si aggiunge un’antimmunoglobulina specifica contro tale anticorpo e coniugata a un enzima come la fosfatasi alcalina o la perossidasi. Si effettua quindi un lavaggio per eliminare l’antimmunoglobulina in eccesso e, nel caso essa sia stata coniugata alla perossidasi, si aggiunge perossido di idrogeno e il substrato cromogeno.

La perossidasi riduce il perossido di idrogeno e ossida il substrato cromogeno producendo colore. Nel caso, invece, in cui l’anticorpo non sia presente nel campione, esso non potrà legarsi all’antimmunoglobulina coniugata con la perossidasi. Quest’ultima, quindi, verrà portata via dal lavaggio e, venendo di conseguenza a mancare anche la perossidasi, l’aggiunta del perossido di idrogeno e del substrato cromogeno non produrrà alcun colore. Per valutare il titolo anticorpale si effettua la reazione in presenza di diluizioni scalari di siero in ragione di due. Il titolo anticorpale è la diluizione massima del siero alla quale l’epifenomeno della reazione antigene-anticorpo risulta ancora apprezzabile.

La diagnosi batteriologica indiretta è, ovviamente, più tardiva della diagnosi batteriologica diretta, in quanto si può ricorrere ad essa soltanto quando si sia già sviluppata la reattività immunitaria dell’ospite e non è sempre possibile, come, ad esempio, in caso di anergia del paziente. Le indagini sierologiche diventano di ausilio diagnostico, pertanto, soltanto quando il microrganismo sia difficile da isolare o qualora il suo isolamento sia, per qualche ragione, fallito.

La diagnosi batteriologica indiretta, non comportando l’isolamento del germe, preclude la possibilità di saggiare la suscettibilità dell’agente eziologico verso i farmaci antimicrobici.

Fonti

  • Koneman, E.W., Color atlas and textbook of diagnostic microbiology, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 1997
  • Lanciotti, E., Microbiologia clinica, 4a ed., Casa Editrice Ambrosiana, Milano, 2017.
  • Murray, P.R., Baron, E.J., Pfalle,r M.A., Tenover, F.C., Yolken, R.H., Manual of clinical microbiology, ASM Press, Washington D.C., 1999.
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